Кишечная палочка производство инсулина

Истечение сахара

Сахарный диабет известен человечеству тысячи лет. Его первыми заметными симптомами обычно бывают сильнейшая жажда и соответствующее ей увеличение объема мочи. Выглядит это так, словно вся жидкость, которую человек выпивает, тут же покидает его тело. Поэтому в древние времена считалось, что диабет — это невозможность удерживать жидкость в организме. Больные быстро худели, практически «высыхали», что, казалось бы, подтверждало гипотезу.

Позже было замечено, что моча таких больных привлекает больше насекомых, чем моча здорового человека. Оказалось, что это происходит благодаря содержанию в ней сахара. К термину diabetes («истечение») был добавлен эпитет mellītus («сладкий, медовый»), однако до понимания причин недуга было еще далеко. Единственным средством, которое тогда предлагалось больным, была полуголодная диета. На ней больные кое-как жили 3–4 года, а потом все равно погибали.

Доказательство «от противного»

Первый серьезный поворот в изучении диабета произошел в Германии в 1889 году. И произошел он случайно.

Физиолог Оскар Минковски, убежденный, что значение поджелудочной железы для пищеварения переоценено, решительно удалил ее у подопытной собаки. Он был уверен, что с животным ничего не случится. Однако через некоторое время ученый обнаружил тот самый феномен сладкой мочи, на которую слетались мухи: собака заболела сахарным диабетом. Внезапно стало ясно, что «антидиабетическое вещество» нужно искать именно в поджелудочной железе.

Эта железа нашего организма словно бы состоит из двух частей, функции которых различны. Одна часть — железистые ацинусы — выделяет в кишечник специальный секрет, участвующий в переваривании пищи. Другая сегодня известна миру под названием «островки Лангерганса» — именно там у здорового человека вырабатывается инсулин — гормон, регулирующий содержание сахара в крови.

В 1900 году русский ученый Леонид Соболев сумел выяснить, что если разрушить только железистую часть органа, диабет у подопытных животных не возникает. При этом вскрытия, которые проводились после смерти больных диабетом, почти всегда показывали поражение островков Лангерганса.

Из этих двух фактов Соболев сделал вывод о том, что средство от диабета надо искать именно в островковой части железы. Он же первым предложил использовать для этого поджелудочные железы новорожденных животных и описал методы выделения «антидиабетического вещества».

От теории — к практике

Реализовать теоретическую разработку Соболева на практике удалось ученым, работавшим в Университете Торонто. Фредерик Бантинг и Чарльз Бест хирургическим путем разрушили «пищеварительную» часть поджелудочной железы собаки, после чего из оставшейся островковой части получили некое вещество, названное «айлетин». У собак с искусственно вызванным сахарным диабетом айлетин снижал уровень сахара в моче и в крови.

Читайте также:

Предиабет

Прежде чем переходить к опытам с участием людей, необходимо было научиться очищать айлетин от примесей — первоначально это был фактически экстракт поджелудочной железы животных. Эта задача была решена биохимиком Джеймсом Коллипом, а очищенный белок назвали «инсулин» (от лат. insula — «островок»).

Первая в мире инъекция инсулина человеку, больному сахарным диабетом, была сделана в 1922 году. Однако опыт оказался не совсем удачным — из-за недостаточной очистки инсулина у 14-летнего Леонарда Томпсона развилась сильная аллергическая реакция. Коллип утроил свои усилия по очистке белка, и уже через 12 дней инъекцию повторили. На этот раз успех был полным: уровень сахара в крови Леонарда снизился, и мальчик сам заметил, что чувствует себя гораздо лучше.

Везучее человечество

«Как же так? — скажет любой человек, не прогуливавший в школе биологию. — Ведь белок, полученный из организма другого биологического вида, должен вызвать аллергию у человека, будь он хоть сто раз очищен?».

Это правда — и в этом суть аллергических реакций: иммунная система распознает «чужаков» и реагирует на них быстро и безжалостно. Однако человечеству удивительно, невероятно повезло. Случайный каприз эволюции: инсулины млекопитающих оказались по строению похожи как близнецы.

Эксперименты показали, что ближе всего к человеческому строение свиного инсулина. Именно он, выделяемый из поджелудочных желез новорожденных поросят, и использовался до 80-х годов прошлого века.

Генномодифицированные организмы

Среди везучего человечества попадались отдельные невезучие диабетики, иммунная система которых была особенно бдительна. У таких людей возникала аллергия на жизненно необходимый им свиной инсулин.

Задача синтеза «инсулина, идентичного натуральному» не теряла своей актуальности. В 1978 году генетик Артур Риггс и биохимик Кэйити Итакура, работавшие в исследовательском институте Бекмана в Калифорнии, сумели ее разрешить. В геном обычной кишечной палочки ввели человеческий ген, «заставляющий» бактерию синтезировать инсулин. Получившийся белок оказался и лучше, и в производстве дешевле свиного. Однако и свиной инсулин пока не ушел в прошлое: его молекулу научились изменять таким образом, что она становится идентичной человеческой.

Но даже после этого биохимики не успокоились. Научившись делать человеческий инсулин, ничем не отличающийся от природного, они захотели добавить ему уникальных свойств. Итогом стали две группы препаратов, получившие название «аналоги инсулина человека».

Первая группа улучшает и ускоряет усвоение принятой пищи, а вторая — нормализует уровень сахара в крови между приемами пищи. Эти лекарства вместе с синтетическими и полусинтетическими инсулинами различной длительности действия составляют «арсенал» современных диабетологов, позволяющий подбирать индивидуальную коррекцию для каждого больного.

Лидия Куликова

Фото istockphoto.com

В настоящее время в мире, по данным ВОЗ (Всемирной организации здравоохранения), насчитывается около 110 млн людей, страдающих диабетом. И эта цифра в ближайшие 25 лет может удвоиться. Диабет- страшное заболевание, которое вызывается нарушением работы поджелудочной железы, вырабатывающей гормон инсулин, необходимый для нормальной утилизации содержащейся в пище углеводов. На начальных этапах развития болезни достаточно использовать меры профилактики, регулярно следить за уровнем сахара в крови, потреблять меньше сладкого. Однако для 10 млн пациентов показана инсулиновая терапия; они вводят в кровь препараты этого гормона. Начиная с двадцатых годов прошлого века для этих целей использовали инсулин, выделенный из поджелудочной железы свиньи и телят. Инсулин животных аналогичен человеческому, разница заключается в том, что в молекуле инсулина свиньи в отличие от человеческого в одной из цепей аминокислота треонин замещена аланином. Считается, что эти незначительные отличия могут вызвать у пациентов серьезные нарушения в работе почек, расстройстве зрения, аллергию). Кроме того, несмотря на высокую степень очистки, не исключена вероятность переноса вирусов от животных к людям. И, наконец, число больных диабетом растет так быстро, что обеспечить всех нуждающихся животным инсулином уже не представляется возможным. И это весьма дорогое лекарство.

Инсулин был впервые выделен из поджелудочной железы быка в 1921 г. Ф Бантингом и Ч. Бестом. Он сотсоит их двух полипептидных цепей, соединенных двумя дисульфидными связями. Полипептидная цепь А содержит 21 аминокислотный остаток, а цепь В- 30 аминокислотных остатков, молекулярная масса инсулина 5, 7 кDа. Ниже представлена аминокислотная последовательность инсулина человека:

Гли-Иле-Вал-Глу-Гли-Цис-Тре-Сер-Иле-Цис-С-Лей-Тир-Гли-Лей-Гли-Лей-Глу-Асн-

Фен-Вал-Асн-Гли-Гис-Лей-Цис-Глу-Сер-Гис-Лей-Вал-Глу-Ала-Лей-Тир-Лей-Вал-Цис-Глу-Глу-

Фен-Вал-Асн-Гли-Гис-Гис-Лей-Цис-Глу-Сер-Гис-Лей-Вал-Глу-Ала-Лей-Тир-Лей-Вал-Цис-Глу-Глу

Трп-Лис-Про-Трп-Тир-Фен-Фен-Глу-Арк

Структура инсулина достаточно консервативна. Аминокислотная последовательность инсулина человека и многих животных различается всего на 1-2 аминокислоты. У рыб по сравнению с животными В- цепь больше и содержит 32 аминокислотных остатка..

Стоимость его была очень высока. Для получения 100 г кристаллического инсулина требуется 800-1000 кг поджелудочной железы, а одна железа коровы весит 200 – 250 грамм. Это делало инсулин дорогим и труднодоступным для широкого круга диабетиков.

Генетическая инженерия, родившись в начале 70-х годов, добилась сегодня больших успехов. Методы генной инженерии преобразуют клетки бактерий, дрожжей и млекопитающих в “фабрики” для масштабного производства любого белка. Это дает возможность детально анализировать структуру и функции белков и использовать их в качестве лекарственных средсв. В настоящее время кишечная палочка (E. coli) стала поставщиком таких важных гормонов как инсулин и соматотропин.

В 1978 году исследователи из компании “Генентек” впервые получили инсулин в специально сконструированном штамме кишечной палочки. Инсулин состоит из двух полипептидных цепей А и В длиной 20 и 30 аминокислот. При соединении их дисульфидными связями образуется нативный двухцепочечный инсулин. Было показано, что он не содержит белков E. coli, эндотоксинов и других примесей, не дает побочных эффектов, как инсулин животных, а по биологической активности от него не отличается. Впоследствии в клетках E. coli был осуществлен синтез проинсулина, для чего на матрице РНК с помощью обратной транскриптазы синтезировали ее ДНК-копию. После очистки полученного проинсулина его расщепили и получили нативный инсулин, при этом этапы экстракции и выделения гормона были сведены к минимуму. Из 1000 литров культуральной жидкости можно получать до 200 граммов гормона, что эквивалентно количеству инсулина, выделяемого из 1600 кг поджелудочной железы свиньи или коровы.

У животных и человека инсулин синтезируется в β- клетках островков Ларгенганса. Гены, кодирующие этот белок у человека, локализованы в коротком плече 11-ой хромосомы. Зрелая инсулиновая мРНК состоит из 330 нуклеотидов, что соответствует 110 аминокислотным остаткам. Именно такое их количество содержит предшественник инсулина – препроинсулин. Он состоит из одной полипептидной цепи, на N- конце которой находится сигнальный пептид (24 аминокислоты), а между А- и В- цепями локализован С- пептид, содержащий 35 аминокислотных остатков.

Процесс созревания инсулина начинается в цисцернах эндоплазматического ретикулума, где под действием фермента сигналазы с N- конца отщепляется сигнальный пептид. Далее в аппарате Гольджи под действием эндопептидаз вырезается С-пептид и образуется зрелый инсулин. На транс- стороне аппарата Гольджи новосинтезированный гормон соединяется с цинком, образуя надмолекулярные структуры (три-, тетра,- пента- и гексамеры), перемещающиеся затем в секреторные гранулы.

Последние отделяются от аппарата Гольджи, перемещаются к цитоплазатической мемебране, ассоциируются с ней, и инсулин секретируется в кровяное русло. Скорость секреции гормона определяется концентрацией глюкозы и ионов Са2+ в крови. Адреналин подавляет освобождение инсулина, а такие гормоны, как ТТГ и АКТГ, напротив, способствуют его секреции. В крови инсулин находится в двух формах: свободной и связанной с белками, преимущественно с транферрином и α2- глобулином. Время «полужизни» инсулина составляет около пяти минут, причем распад начинается в крови, т.к. в эритроцитах имеются инсулиновые рецепторы и довольно активная инсулин- деградирующая система. Инсулиназа эритроцитов является Са- зависимой, тиоловой протеиназой, функционирующей совместно с глутатион- инсулин-ирансгидрогеназой, расщепляющей дисульфидные связи между двумя полипептидными цепями инсулина.

Фрагментация инсулина и его распад происходят преимущественно в печени, почках и плаценте.

Фрагменты инсулина обладают биологической активностью и участвуют в ряде метаболических процессов. Одной из осеовных функций инсулина является регуляйия транспорта глюкозы, аминокислот, ионов и др. метаболитов в клетки печени, почек, жировой ткани др. органов. Механизм действия этого гормона отличается от такового для др. пептидных гормонов и является уникальным в регуляции метаболических процессов. Инсулиновый рецептор представляет собой тетрамер, состоящий из двух α- и двух β-субъединиц, одна из которых обладает тироксиназной активностью. Инсулин при взаимодействии с α-субъединицами, расположенными на поверхности цитоплазматической мембраны, образует гормон- рецепторный комплекс. Конформационные изменения тетрамера приводят к активации трансмембранной β-субъединицы рецептора, обладающей тирозинкиназной активностью. Активная тирозинкиназа способна к фосфорилированию мембранных белков.Образуются мембранные каналы, через которые глюкоза и др. метаболиты проникают в клетки. Свободный инсулин под действием тканевой инсулиназы распадается на семь фракций, пять из которых обладают биологической активностью.

Кроме того, инсулин стимулирует ряд биосинтетических процессов: синтез нуклеотидов, нуклеиновых кислот, ферментов гликолиза и пентозофосфатного цикла, гликогена. В жировой ткани инсулин активирует процесс образования ацетил Ко А и жирных кислот. Он является одним из индукторов синтеза холестерина, глицерина и глицераткиназы.

Мутации в структуре инсулинового гена, нарушение механизмов посттранскрипционного и посттрансляционного процессинга приводят к образованию дефектных молекул инсулина и, как следствие, к нарушению обменных процессов, регулируемых данным гормоном. В результате развивается тяжелое заболевание – сахарный диабет.

Разработка технологии производства искусственного инсулина является поистине триумфом генетиков. Сначала с помощью специальных методов определили строение молекулы этого гормона, состав и последовательнгсть аминокислот в ней. В 1963 г. молекулу инсулина синтезировали с помощью биохимических методов. Однако осуществить в промышленном масштабе столь дорогостоящий и сложный синтез, включающий 170 химических реакций, оказалось сложно.

Поэтому в дальнейших исследованиях упор был сделан на разработку технологии биологического синтеза гормона в клетках микроорганизмов, для чего использовали весь арсенал методов генетической инженерии. Зная последовательность аминокислот в молекуле инсулина, ученые рассчитали, какой должна быть последовательность нуклеотидов в гене, кодирующем этот белок, чтобы получить нужную последовательность аминокислот. «Собрали» молекулу ДНК из отдельных нуклеотидов в соответствии с определенной последовательностью, «добавили» к ней регуляторные элементы, нкеобходимые для экспрессии гена в прокариотическом организме Е.coli, и встроили эту конструкцию в генетический материал микроба. В результате бактерия смогла вырабатывать две цепи молекулы инсулина, которые в дальнейшем можно было соединить с помощью химической реакции и получить полную молекулу инсулина.

Наконец, ученым удалось осуществить в клетках Е.coli биосинтез молекулы проинсулина, а не только ее отдельных цепей . Молекула проинсулина после биосинтеза способна соответствующим образом преобразовываться (формируются дисульфидные связи между цепями А и В), превращаясь в молекулу инсулина. Эта технология имеет серьезные преимущества, поскольку различные этапы экстракции и выделения гормона сведены до минимума. При разработке такой технологии была выделена информационная РНК проинсулина. Используя ее в качестве матрицы, с помощью фермента обратной транскриптазы синтезировали комплементарную ей молекулу ДНК, которая представляла собой практически точную копию натурального гена инсулина. После пришивания к гену необходимых регуляторных элементов и переноса конструкции в генетический материал Е.coli

Стало возможным производить инсулин на микробиологической фабрике в неограниченных количествах. Его испытания показали практически полную идентичность натуральному инсулину человека. Он намного дешевле препаратов животного инсулина, не вызывает осложнений.

Соматотропин – гормон роста человека, секретируемый гипофизом. Недостаток этого гормона приводит к гипофизарной карликовости. Если вводить соматотропин в дозах 10 мг на кг веса три раза в неделю, то за год ребенок, страдающий от его недостатка, может подрасти на 6 см. Ранее его получали из трупного материала, из одного трупа: 4 – 6 мг соматотропина в пересчете на конечный фармацевтический препарат. Таким образом, доступные количества гормона были ограничены, кроме того, гормон, получаемый этим способом, был неоднороден и мог содержать медленно развивающиеся вирусы. Компания “Genentec” в 1980 году разработала технологию производства соматотропина с помощью бактерий, который был лишен перечисленных недостатков. В 1982 году гормон роста человека был получен в культуре E. coli и животных клеток в институте Пастера во Франции, а с 1984 года начато промышленное производство инсулина и в СССР. При производстве интерферона используют как E. coli, S. cerevisae (дрожжи), так и культуру фибробластов или трансформированных лейкоцитов. Аналогичными методами получают также безопасные и дешевые вакцины.

На технологии рекомбинантных ДНК основано получение высокоспецифичных ДНК-зондов, с помощью которых изучают экспрессию генов в тканях, локализацию генов в хромосомах, выявляют гены, обладающие родственными функциями (например, у человека и курицы). ДНК-зонды также используются в диагностике различных заболеваний.

Технология рекомбинантных ДНК сделала возможным нетрадиционный подход “белок-ген”, получивший название “обратная генетика”. При таком подходе из клетки выделяют белок, клонируют ген этого белка, модифицируют его, создавая мутантный ген, кодирующий измененную форму белка. Полученный ген вводят в клетку. Если он экспрессируется, несущая его клетка и ее потомки будут синтезировать измененный белок. Таким образом можно исправлять дефектные гены и лечить наследственные заболевания.

Если гибридную ДНК ввести в оплодотворенное яйцеклетку, могут быть получены трансгенные организмы, экспрессирующие мутантный ген и передающие его потомками. Генетическая трансформация животных позволяет установить роль отдельных генов и их белковых продуктов как в регуляции активности других генов, так и при различных патологических процессах. С помощью генетической инженерии созданы линии животных, устойчивых к вирусным заболеваниям, а также породы животных с полезными для человека признаками. Например, микроинъекция рекомбинантной ДНК, содержавшей ген соматотропина быка в зиготу кролика позволила получить трансгенное животное с гиперпродукцией этого гормона. Полученные животные обладали ярко выраженной акромегалией.

Сейчас даже трудно предсказать все возможности, которые будут реализованы в ближайшие несколько десятков лет.

Лекция 5. Комплексная переработка биологического сырья

Под комплексной переработкой биологического сырья понимают совокупность технологических процессов (технологий), направленных на получение продуктов различной природы из одного источника. Таким источником может являться биомасса промышленных микроорганизмов, водоросли, растительные и животных клетки и отходы сельскохозяйственной промышленности.

При этом важно, чтобы себестоимость всех продуктов комплексной переработки сырья была ниже суммы себестоимостей каждого вида товарного продукта, полученного в производстве с учетом затрат на природоохранные мероприятия. Особенное значение это имеет при переработке биологического сырья, которое включает природные биополимеры белковой, углеводной , липидной и нуклеотидной природы. Клетки, содержащие их в значительных количествах, представляют интерес для комплексной переработки, поскольку позволяют выделять из них ценные продукты, прежде всего пищевого и медицинского назначения.

Различия в физико-химических свойствах природных биополимеров предопределяют выбор технологических приемов их выделения и очистки. Например, глубина комплексной переработки микробиологического сырья может быть различной. Применяемые в ней технологии должны быть гибкими, а объем выпускаемой продукции должен отвечать потребностям рынка. При переработке микробной массы с целью получения продуктов липидной природы используют бактерии, дрожжи, микроскопические грибы и водоросли. Продукты полинуклеотидной и белковой природы получают из биомассы бактерий и дрожжей.

В биотехнологическом производстве продуктов основой является оборудование и особенно, связанное со стадией ферментации, так как определяет состав и свойства биопродуктов и культуральной жидкости. Кроме того, в большинстве случаев именно на стадии ферментации закладываются основные экономические показатели биотехнологического производства и конкурентноспособность получаемых биопродуктов.

Существуют различные биотехнологические способы интенсификации ферментации: использование более активного штамма- продуцента, аппаратурное усовершенствование, оптимизация состава питательной среды и условий культивирования, применение биостимуляторов, эмульгаторов и т.д. Все они способны обеспечить максимальную продуктивность биотехнологического процесса и повысить выход конечного продукта.

В то же время наиболее существенное влияние на характер протекания процесса ферментации и его конечные технологические показатели оказывает аппаратура. Рассматривая многообразие ферментационных аппаратов, применяемых в настоящее время в биохимических производствах, можно сделать вывод, что во всех реакторах происходят определенные физические процессы (гидродинамические, тепловые и массообменные), с помощью которых создаются оптимальные условия для проведения собственно биохимического превращения вещества (биохимической реакции).

Для осуществления этих физических процессов биохимический реактор снабжается типовыми конструктивными элементами, широко применяемыми также в химических аппаратах для проведения собственно физических процессов (мешалки, контактные устройства, теплообменники, диспергаторы и т.д.). Ферментер любой конструкции должен удовлетворять основным требованиям процесса культивирования клеток: обеспечить подвод к каждой клетке питательных веществ, отвод продуктов метаболизма, обеспечить поддержание оптимальных рабочих параметров, требуемый уровень аэрирования, перемешивания, высокий уровень автоматизации и т.д.

Значение биохимии в биотехнологии

Фундаментальная биохимия является основой для многих наук биологического профиля, таких, как генетика, физиология, иммунология, микробиология. Успехи клеточной и генной инженерии в последние годы в значительной мере сблизили биохимию с зоологией и ботаникой. Велико значение биохимии для таких наук, как фармакология и фармация. Биологическая химия изучает различные структуры на клеточном и организменном уровнях. Основой жизни является совокупность химических реакций, обеспечивающих обмен веществ. Таким образом биохимию можно считать основным языком всех биологических наук. В настоящее время как биологические структуры, так и обменные процессы, благодаря применению эффективных методов, изучены достаточно хорошо. Многие разделы биохимии в последние годы развивались столь интенсивно, что выросли в самостоятельные научные направления и дисциплины. Прежде всего можно отметить биотехнологию, генную инженерию, биохимическую генетику, экологическую биохимию, квантовую и космическую биохимию и т.д. Велика роль биохимии в понимании сути патологических процессов и молекулярных механизмов действия лекарственных веществ.

Все живые организмы состоят из клеток и продуктов их метаболизма. Это в 1838 году доказали М.Шлейден и Т.Шванн, которые постулировали, что растительные и животные организмы построены из клеток, расположенных в определенном порядке. Спустя 20 лет Р.Вирхов сформулировал основы клеточной теории, указав, что все живые клетки возникают из предшествующих живых клеток. В дальнейшем клеточная теория развивалась и дополнялась по мере совершенствования методов познания. Каждая клетка является обособленной функциональной единицей, имеющей ряд специфических особенностей, в зависимости от ее природы. Микроорганизмы представлены отдельными клетками или их колониями, а многоклеточные организмы, например животные или высшие растения, состоят из миллиардов клеток, соединенных друг с другом. Клетка представляет собой своеобразную фабрику, на которой осуществляются многообразные и согласованные химические процессы, как и на реальной фабрике, в клетке имеется центр управления, участки контроля за теми или иными реакциями, регуляторные механизмы. В клетку также поступает сырье, которое перерабатывается в готовую продукцию, и отходы, которые выбрасываются из клетки.

Клетки постоянно синтезируют вещества, необходимые для их жизнедеятельности. Эти вещества находят все большее применение в промышленности и медицине. Некоторые из них уникальны и не могут быть получены методом химического синтеза.