Белок связывающий жирные кислоты кишечная форма

Общая характеристика БСЖК

Белок, связывающий жирные кислоты принадлежит к целой семье неэнзиматических белков, принимающих участие во внутриклеточном транспорте жирных кислот. Первые сведения об этих белках появились в начале семидесятых годов. Семейство белков, связывающих жирные кислоты, состоит из сравнительно большого количества цитозольных белков молекулярной массой 12–16 kDa, которые классифицируются в зависимости от их содержания в различных тканях, характеризующихся активным метаболизмом жирных кислот. Так, например, выделяют сердечную изоформу FABP (сБСЖК, h-FABP, FABP3), печёночную (L-FABP, FABP1), тонкокишечную (I-FABP, FABP2), мозговую (B-FABP, FABP7), эпидермальную (E-FABP, FABP5), адипоцитарную (A-FABP, FABP4) и тестикулярную (T-FABP, FABP9).

Первичная структура различных типов FABP была довольно хорошо изучена. Полипептидная цепь молекулы включает около 130 аминокислотных остатков. Все основные типы FABP ацетилированы с N-конца. Во многих случаях FABP существует в двух изоформах, различающихся по заряду: одна форма имеет pI 4.9, а другая – 5.1. После определения полной аминокислотной последовательности очищенных изоформ было обнаружено, что существование этих двух форм связано с единственной аминокислотной заменой аспарагина в положении 98 на аспарагиновую кислоту.

Трехмерная структура FABP представляет собой два b-слоя, образованные каждый пятью антипараллельными b-тяжами (Рис.1) С помощью ряда водородных связей b-слои образуют структуру, напоминающую двустворчатую раковину, внутри которой располагается так называемая b-полость в которой происходит связывание и удерживание лиганда. Сверху b-полость накрыта своеобразной «крышкой», образованной двумя a-спиралями. Эти a-спирали, находящиеся в N-концевом участке молекулы FABP (15–35 аминокислотные остатки), формируют структуру «a-спираль — поворот — a-спираль». Эта структура характерна для класса ДНК-связывающих белков.

Связывание лиганда внутри молекулы FABP обусловлено образованием сети водородных связей между карбоксильной группой молекулы жирной кислоты и боковыми цепями аминокислотных остатков, входящих в состав молекулы FABP. При этом происходит также вовлечение во внутреннюю полость белка двух дополнительных молекул воды, которые также участвуют в образовании сети водородных связей, а жирная кислота принимает U-образную конформацию.

Рис. 1. Трёхмерная структура сердечной изоформы FABP.

Кристаллографические исследования показали, что наиболее важными для образования этих водородных связей являются аминокислотные остатки треонина в положении 40, двух аргининов в положениях 106 и 126, а также тирозина в положении 128. Также обнаружено, что остатки фенилаланина в положениях 16 и 57 играют важную роль во взаимодействии с ацильной цепочкой жирной кислоты. Фенильное кольцо Phe16 играет очень важную роль в связывании лиганда. Замена этого аминокислотного остатка на тирозин приводит к полному прекращению связывания. Фенильное кольцо Phe16 находится в тесной близости от ацильной цепи и может быть ключевым участком лигандной специфичности и аффинитета сердечного FABP.

FABP как маркер инфаркта миокарда

Исследования, проведенные в целях количественного определения содержания h-FABP в клетках сердца, показали, что основная масса h-FABP содержится в цитоплазме, часть h-FABP была обнаружена в матриксе митохондрий и очень небольшая часть — в ядре.

Сердечная изоформа FABP — это небольшой (132 а.к.о., молекулярная масса около 14858 Да), нейтральный цитозольный белок (pI: 6,29), отвечающий за транспорт жирных кислот и других липофильных веществ внутри клетки. Сердечная форма FABP по своему аминокислотному составу отличается от других известных форм белка, и эти отличия делают возможным селективное определение h-FABP в крови больного с использованием иммунохимических методов.

Впервые предложение об использовании сердечного FABP в качестве маркера инфаркта миокарда (ИМ) было высказано Глатцом (Glatz) и его коллегами в 1988 году. Через некоторое время в литературе появились данные о том, что h-FABP можно использовать и для диагностики нестабильной стенокардии.

Очевидны преимущества h-FABP как маркера некроза клеток сердца: небольшая молекулярная масса и локализация в цитоплазме, т.е. раннее появление в кровяном русле больных; высокая концентрация в клетках сердца, а значит значительное увеличение концентрации по сравнению с нормальным содержанием в крови; наличие кардиоспецифичной изоформы.

В процессе исследования локализации сердечной изоформы FABP, было обнаружено, что h-FABP существует не только в сердце. Различные количества h-FABP обнаружены в скелетных мышцах, печени, почках, надпочечниках, легких, кишечнике и мозге. Это очень сильно снижает ценность h-FABP как маркера некроза миоцитов. Не смотря на это, концентрация h-FABP в различных тканях очень сильно варьирует. Например, было показано, что соотношение концентрации h-FABP в сердечной и скелетной мышцах составляет примерно 20:1, единственная мышца, в которой относительно большее количество h-FABP — это диафрагма (примерно 25% от сердечного). В почке содержится в 10 раз меньше сБСЖК, чем в сердце. В печени, кишечнике, легких содержание h-FABP было крайне незначительным.

По сравнению с миоглобином у h-FABP есть целый ряд преимуществ. Во-первых, верхняя граница нормы для FABP, гораздо ниже, чем у миоглобина. Для миоглобина это значение соответствует 40-60 нг/мл. Было показано, что в сердечной мускулатуре содержание миоглобина составляет примерно 2,7 мг на грамм ткани, а в скелетной мышце — 2,2–6,7 мг/г (соотношение сердце/скелетная мышца находится в пределах 1,2-0,4 раз). Содержание h-FABP в сердце несколько ниже миоглобина (примерно 0,6 мг на грамм ткани), и почти в 10 раз ниже, чем его содержание в тканях скелетной мускулатуры — 0,04–0,14 мг/г (соотношение сердце/скелетная мускулатура от 14 до 4 раз).

Во-вторых, молекулярная масса h-FABP несколько ниже, чем у миоглобина. В связи с этим, концентрация h-FABP в крови больного может вырастать в 100 и более раз по сравнению с фоновым значением, что существенно больше, чем соотношение сигнал/фон для того же миоглобина. Например, у пациентов с массивной травмой мышечной ткани отношение миоглобин/h-FABP находилось в диапазоне от 20 до 70, тогда как при некрозе сердечной мышцы оно составляло 4,5. Ввиду своих размеров h-FABP немного быстрее миоглобина выводится из кровяного русла и, следовательно, его скорее можно обнаружить в моче пациентов. Причем, уровень содержания h-FABP в моче пациентов порой бывает значительно выше, чем миоглобина. Возможность тестирования h-FABP в моче может облегчить процедуру проведения анализа.

При проведении исследований по сравнению эффективности тестирования миоглобина и h-FABP было показано, что, в отличие от миоглобина, h-FABP не был обнаружен ни в сыворотке крови, ни в моче пациентов, у которых боли в области грудины были обусловлены заболеваниями, не связанными с некрозом клеток миокарда (гипертрофическая необструктивная миопатия, перикардит).

На сегодня в литературе существуют разночтения относительно нижнего предела нормы для FABP, так как изучение его как маркера ИМ началось гораздо позже, чем миоглобина, и гораздо менее интенсивно. Отсутствие на данный момент единого иммунологического стандарта ведет к значительным различиям в данных для каждой конкретной диагностической системы. Диапазон содержания h-FABP в крови здоровых доноров достаточно широк: от 1,6 до 10 нг/мл. Большинство исследователей приводят среднее значение 4–6 нг/мл (против 40 нг/мл для миоглобина).

Вышеописанные различия в распределении белков в тканях помогает разграничивать случаи повреждения миокарда и повреждения скелетных мышц. Указанные особенности h-FABP делают его значительно более кардиоспецифичным и более чувствительным маркером гибели кардиомиоцитов, чем миоглобин. Показано, что h-FABP может использоваться для диагностирования даже незначительных повреждений сердечной мышцы. Проведенные исследования показали, что h-FABP может использоваться в качестве надежного маркера гипертрофической и дилатационной кардиомиопатии, сердечной недостаточности, реперфузии, при необходимости ранней оценки размера инфаркта, а также в целях раннего выявления послеоперационной потери ткани миокарда у пациентов, перенесших коронарное шунтирование, подверженных инсульту и обструктивному синдрому апноэ во время сна. Кроме того, уровень содержания h-FABP является показателем риска смерти во время длительного наблюдения среди пациентов с хронической тромбоэмболической легочной гипертензией. Наконец, представляется, что H-FABP может использоваться в качестве маркера для успешного обнаружения повреждения миокарда в раннем, бессимптомном периоде среди больных, страдающих метаболическим синдромом. Однако, из-за недостаточной кардиоспецифичности сБСЖК невозможно поставить достоверный диагноз, основываясь только на данных тестирования h-FABP в крови больного.

Использование БСЖК в клинической практике

Концентрация FABP в сыворотке крови не зависит от времени суток и практически не меняется с возрастом. Изменение концентрации h-FABP в крови больного наблюдается уже через 1–3 часа после появления симптомов заболевания, достигая максимума (до 300 нг/мл и выше) через 6–8 часов, после чего в течение 12-24 часов возвращается к нормальной концентрации (Рис.2). Такое свойство FABP оказывается особенно важным для диагностирования повторных инфарктов, возникающих у больного через короткий промежуток времени (от одного до нескольких дней) после первого приступа. В это время использование как ЭКГ, так и измерения концентрации тропонинов считается малоэффективным ввиду изменений, сохранившихся со времени предыдущего ИМ.

Рис. 2. Динамика изменения в крови больного с ИМ концентрации h-FABP (-●-) и тропонина I (-■-) по сравнению с нормой.

Еще одна немаловажная область применения h-FABP в клинической практике — это контроль за лечением пациентов. Быстрое появление h-FABP в крови после начала некроза миоцитов дает возможность контролировать возможные повреждения сердечной мышцы во время операций на сердце, а также оценивать эффективность проведенного тромболизиса.

К недостаткам использования h-FABP в качестве диагностического маркера инфаркта миокарда относят сравнительно низкую (по сравнению с тропонинами) кардиальную специфичность, меньшее диагностическое окно (1-24 часа после возникновения болей в груди) и его преимущественное выведение из плазмы через механизм почечного очищения, что может привести к возникновению ложно высоких значений белка при нарушении функции почек. Тем не менее, указанные недостатки могут быть преодолены путем одновременного использования поздних и более специфичных маркеров, таких как кардиоспецифичный тропонин I (cTnI).

Использование сБСЖК в иммунохроматографии

Для количественного определения FABP в клиниках, как правило, используются автоматические анализаторы, способные провести исследования образца за короткий промежуток времени (15-45 минут). Однако, сегодня в России разрабатываются относительно дешевые и простые системы экспресс диагностики, основанные на принципе иммунохроматографии, для качественного определения h-FABP, пригодные для использования даже в машинах скорой помощи, ввиду достаточно высокой концентрации белка в крови больного, для определения которой не требуется сложных высокочувствительных систем (рис. 3). Подобные иммунохроматографические тест-системы позволяют выявить в крови сердечный БСЖК в течение 10-20 минут, что даёт возможность врачам в более ранние сроки начать своевременное лечение, предотвратив неблагоприятный исход.

Рис. 3. Тест-системы российского производства для быстрого определения повышенного уровня сБСЖК. А – «КАРД-ИНФО», продукт ООО «ОФК-Кардио»; Б – «КардиоБСЖК» – продукт ООО НПО «БиоТест».

Моноклональные антитела к БСЖК компании Биалекса могут быть использованы для проведения высокочувствительных и быстрых иммунологических исследований различными методами. Проводимые нашей компанией исследования сэндвич-методом имеют линейный диапазон детектирования от 0,15 до 500 мкг/л (с пределом обнаружения 0,05 мкг/л). Все рекомендованные комбинации моноклональных антител прошли клинические испытания с образцами крови пациентов, страдающих ОИМ.

Белок, связывающий жирные кислоты (антиген)

Моноклональные антитела к белку, связывающему жирные кислоты