Человеческий инсулин с использованием кишечной палочки получают путем

Инсулин – это белок, который является гормоном поджелудочной железы. Действие инсулина в основном направлено на обмен углеводов и проявляется снижением уровня сахара в крови (гипогликемический эффект). Это происходит за счет того, что инсулин облегчает переход глюкозы в клетки органов и тканей, где стимулирует ее активирование путем образования глюкозо-6-фосфата.

Последний, окисляясь, обеспечивает клетки энергией. Таким образом, инсулин способствует периферическому окислению глюкозы. Наряду с этим инсулин тормозит распад гликогена в клетках печени. При этом снижаются процессы распада жиров и превращение аминокислот в глюкозу и происходит активирование синтеза жиров и белков.

При недостатке инсулина развивается тяжелое заболевание – диабет; при этом разрушается нормальный обмен веществ. Диабетики должны получать инсулин ежедневно, если этого не происходит, то развивается тяжелое состояние – диабетическая кома, и организм погибает. Потребность в инсулине огромна. Долгое время источником инсулина служили железы коров и свиней. Учитывая, что поджелудочная железа коровы весит 200-250 г, для получения 100 г кристаллического инсулина нужно 800-1000 кг исходного сырья. Понятно, что животный инсулин не мог обеспечить всех больных. Например, в 1979 г. из 60-ти млн больных диабетом во всем мире, только 4 млн получали препарат инсулина.

Инсулин построен из двух полипептидных цепей А и В длиной 20 и 30 аминокислот, последовательность которых была установлена Сэнгером в 1955 г. Синтез обеих цепей и соединение их дисульфидными связями для получения инсулина были проведены тремя коллективами исследователей в Сша, Китае и ФРГ в 1963 и 1965 гг. Однако осуществить в промышленном масштабе столь дорогостоящий и сложный синтез, который включает 170 химических реакций, оказалось трудно. Тем не менее в 1980 г. в Дании (компанией «Ново индастри») был разработан способ превращения инсулина свиньи в инсулин человека замещением остатка аланина, который является 30-й аминокислотой в цепи В на остаток треонина.

Это удалось достигнуть путем ферментативного замещения с последующей хроматографической очисткой продукта; в результате был получен однокомпонентный инсулин человека 99 %-й чистоты. Исследования двух однокомпонентных инсулинов (человеческого и свиного) показали, что они не различались по активности и по времени действия. В 1982 г. инсулин производили главным образом две компании «Эли Лилли» (85 % сбыта инсулина в США и патент на его производство с 1923 г.) и «Ново индастри» (47,5 % сбыта гормона в Европе).

В организме животного две полипептидные цепи инсулина исходно являются частями одной белковой молекулы длиной 109 аминокислот – препроинсулина. При синтезе препроинсулина в клетках поджелудочной железы первые 23 аминокислоты служат сигналом для прохождения молекулы сквозь мембрану клетки; эти аминокислоты отщепляются, образуется проинсулин длиной 86 аминокислот. Молекула проинсулина сворачивается таким образом, что начальный и конечный ее сегменты сближаются, а центральная часть молекулы удаляется с помощью ферментов.

Так образуется инсулин. Роль центральной части сводится к правильному взаимному расположению двух цепей инсулина.

Гилберт с сотрудниками выделили и-РНК из поджелудочной железы крысы, синтезировали ДНК-копию (комплементарная ДНК), которая была встроена в плазмиду E. coli в среднюю часть гена пенициллиназы (этот фермент в норме секретируется из клеток), и получили рекомбинантную плазмиду. Как показало определение последовательности ДНК, рекомбинантная плазмида содержала информацию о структуре проинсулина, но не препроинсулина.

При трансляции и-РНК в клетках кишечной палочки синтезировался гибридный белок, содержащий последовательности пенициллиназы и проинсулина. Далее отщепляли пенициллиназу и удаляли средний сегмент проинсулина действием трипсина. Позднее было показано, что полученные таким образом молекулы влияют на сахарный обмен, как гормон, выделенный из поджелудочной железы крысы.

В 1979 г. в США были синтезированы гены, кодирующие А и Б цепи инсулина. Далее каждый синтетический ген встраивали в плазмиду E. coli в конце гена -галактозидазы. После этого синтезированные полипептиды отщепляли от фермента, проводили их очистку и цепи соединяли in vitro для получения полной молекулы инсулина.

В клетках E. coli был также осуществлен биосинтез проинсулина, а не только отдельных ее цепей. Для этого на и-РНК проинсулина синтезировали ее ДНК-копию с помощью обратной транскриптазы (ДНК-полимераза). Этот способ имеет серьезное преимущество, поскольку различные этапы экстракции и выделения гормона сведены к минимуму. С помощью этого метода был получен высокий выход гормона -200 г на 1000 л культуральной жидкости (это эквивалентно количеству инсулина, выделенного из 1600 кг поджелудочной железы животных).

Исследователям из компании «Генентек» потребовалось 10 месяцев, чтобы в сентябре 1978 г. получить инсулин человека в специально сконструированном штамме кишечной палочки. Этот инсулин прошел самые серьезные и длительные испытания, которые показали, что он не вызывает никаких побочных явлений, как инсулин животных (у одного из каждых 20-ти больных инсулин животных вызывает аллергию; часто наблюдаются также расстройства почек и зрения ).

Кроме того, при длительном применении препарат не вызывал отрицательных иммунологических реакций.

Технология производства инсулина в бактериальных клетках имеет огромные преимущества перед получением инсулина из поджелудочной железы животных: не зависит от перебоев или количества сырья, конечный продукт всегда имеет одинаковый состав и степень чистоты.

В октябре 1982 г. был налажен выпуск «хемулина» (препарата синтетического инсулина человека) фирмой «Эли Лилли», которая затратила 100 млн долларов, чтобы начать поставку продукта на рынок.

Л.В. Тимощенко, М.В. Чубик

Опубликовал Константин Моканов

Источник

Инсулин человеческий генно-инженерный: наука на службе у человечества

До применения инсулина продолжительность жизни больного сахарным диабетом составляла не более 10 лет. Изобретение этого препарата спасло миллионы пациентов. Человеческий генно-инженерный инсулин – последнее достижение науки.

Результат многолетней напряженной работы

История

До изобретения генно-инженерного (рекомбинантного) препарата инсулин выделяли из поджелудочной железы крупного рогатого скота и свиней.

Отличие свиного инсулина от человеческого – только одна аминокислота

Недостатки этого способа получения препарата:

сложность хранения и транспортировки биологического сырья;
недостаток поголовья скота;
трудности, связанные с выделением и очисткой гормона поджелудочной железы;
высокий риск развития аллергических реакций.

С синтезирования в биореакторе натурального человеческого инсулина в 1982 году началась новая биотехнологическая эпоха. Если на заре инсулинотерапии целью ученых было только выживание пациента, в наше время разработка новых препаратов направлена на достижение стойкой компенсации заболевания. Основная цель научных разработок – улучшить качество жизни больного сахарным диабетом.

Современные технологии

Виды препарата в зависимости от способа получения:

Что происходит в организме после введения препарата?

Соединяясь с рецептором клеточной мембраны, инсулин образует комплекс, который осуществляет следующие процессы:

Улучшает внутриклеточную транспортировку глюкозы и облегчает ее усваивание.
Способствует выделению ферментов, которые участвуют в переработке глюкозы.
Снижает скорость образования в печени гликогена.
Стимулирует жировой и белковый обмен.

В случае подкожного введения инсулин начинает действовать через 20-25 минут. Время действия препарата от 5 до 8 часов. В дальнейшем расщепляется ферментом инсулиназой и выводится с мочой. Препарат не проникает через плаценту и не попадает в грудное молоко.

Когда назначают генно-инженерный инсулин?

Генно-инженерный человеческий инсулин применяется в следующих случаях:

Сахарный диабет 1 или 2 типа. Используется в качестве самостоятельного лечения или в комплексе с другими препаратами.
При резистентности к пероральным сахароснижающим средствам.
При диабете у беременных женщин.
В случае осложнений со стороны почек и печени.
При переходе на инсулин пролонгированного действия.
В предоперационном периоде.
В случае развития угрожающих жизни состояний (гиперосмолярной или кетоацидотической комы).
В экстренных ситуациях (перед родами, при травмах).
Если имеются дистрофические поражения кожи (язвы, фурункулез).
Лечение сахарного диабета на фоне инфекции.

Человеческий генно-инженерный инсулин хорошо переносится и не вызывает аллергических реакций, так как полностью идентичен природному гормону.

Важен постоянный контроль!

Запрещено назначение лекарства в случае:

снижения уровня сахара в крови;
повышенной чувствительности на препарат.

В первые дни после назначения препарата необходимо внимательное наблюдение за пациентом.

Побочные эффекты

В редких случаях при применении инсулина возможны следующие осложнения:

аллергические реакции (крапивница, отек Квинке, зуд кожи);
резкое снижение уровня сахара в крови (развивается из-за отторжения препарата организмом или в случае иммунологического конфликта);
нарушения сознания;
в тяжелых случаях возможно развитие гипогликемической комы;
жажда, сухость во рту, вялость, снижение аппетита;
гипергликемия (при применении препарата на фоне инфекции или лихорадки);
покраснение лица;
местные реакции в области введения (жжение, зуд, атрофия или разрастание подкожной жировой клетчатки).

Иногда адаптацию к препарату сопровождают такие нарушения, как отеки и нарушения зрения. Эти проявления, как правило, исчезают через несколько недель.

Как найти в аптеке генно-инженерный инсулин?

Лекарство выпускается в виде раствора для парентерального введения:

Подобрать препарат инсулина с учетом индивидуальных особенностей пациента не составит труда.

Важно! Назначать инсулин может только врач! Он же рассчитывает дозу и контролирует состояние пациента во время курса лечения. Самолечение может привести к трагическим последствиям.

Правила использования

Чаще всего применяется подкожное введение инсулина.

В неотложных случаях лекарство вводится внутривенно.

При тяжелом состоянии пациента

Даже диабетик со стажем может допустить ошибку при применении препарата.

Для того, чтобы избежать осложнений, необходимо:

Перед использованием проверить срок годности лекарства.
Соблюдать рекомендации по хранению: запасные флаконы должны храниться в холодильнике. Начатый флакон можно хранить при комнатной температуре в темном месте.
Убедитесь, что хорошо запомнили нужную дозировку: еще раз прочитайте рецепт врача.
Перед инъекцией обязательно выпустить воздух из шприца.
Кожа должна быть чистой, но использовать спирт для обработки нежелательно, так как он снижает эффективность препарата.
Выбрать оптимальное место для инъекции. При введении под кожу живота препарат подействует быстрее. Медленнее всасывается инсулин при введении в ягодичную складку или плечо.
Использовать всю площадь поверхности (профилактика развития местных осложнений). Расстояние между инъекциями должно быть не меньше 2 см.
Захватить кожу в складку, чтобы снизить риск попадания в мышцу.
Шприц вводить под кожу под углом, чтобы лекарство не вытекло.
При инъекциях в живот инсулин короткого действия вводить за 20 минут до приема пищи. В случае выбора плеча или ягодицы – за тридцать минут до еды.

Сочетание с другими лекарственными средствами

Зачастую при сахарном диабете больной принимает несколько медицинских препаратов. Сочетание с другими лекарственными средствами может оказать влияние на лечебное действие генно-инженерного инсулина.

Для профилактики осложнений необходимо знать:

Передозировка

В некоторых случаях введение инсулина приводит к внезапному снижению уровня сахара в крови. Проблема часто возникает из-за неправильного подбора дозы препарата.

Начальные симптомы гипогликемии:

слабость;
бледность кожи;
состояние тревоги;
головокружение;
дезориентация;
онемение рук, ног, языка и губ;
дрожь конечностей;
холодный пот;
сильное чувство голода;
головные боли.

Тремор Внезапное ухудшение самочувствия

Если вы заметили у себя подобные симптомы, нужно быстро съесть что-нибудь, содержащее легкоусвояемые углеводы. Это может быть печенье, конфета, кусочек сахару или белого хлеба. Хорошо помогает в таких ситуациях сладкий чай.

При ухудшении состояния необходимо вызвать скорую помощь. Гипогликемия может закончиться комой или смертью пациента.

Врачебная помощь: струйное вливание в вену 40% раствора глюкозы, введение глюкагона.

Частые вопросы врачу

Применение генно-инженерного инсулина при беременности

Добрый день! Меня зовут Снежана. С детства страдаю сахарным диабетом. В последнее время использую «Актрапид». Несколько дней назад узнала о своей беременности. Я боюсь, что генно-инженерный препарат может повлиять на развитие ребенка, вызвать какие-нибудь мутации. Скажите пожалуйста, может мне заменить лекарство?

Здравствуйте, Снежана. Человеческий генно-инженерный инсулин не проникает через плаценту и совершенно безопасен при беременности. Вам нужно обратиться к эндокринологу для того, чтобы скорректировать дозу.

Опасен ли рекомбинантный инсулин?

Добрый день! Врач назначил колоть «Хумалог Микс 25». Но на упаковке написано, что он рекомбинантный! Это что же, я буду вводить себе ГМО? Прочитал в интернете, что эти продукты вызывают рак.

Здравствуйте! Рекомбинантный инсулин ничем не отличается от природного. Для получения его используются генно-модифицированные бактерии.

С помощью технологий генной инженерии производится вживление рекомбинантной ДНК, содержащей ген инсулина, в клетку кишечной палочки. Генно-модифицированные организмы размножаются и вырабатывают гормон. Препарат очень эффективен и отличается высокой степенью очистки.

Источник статьи: https://diabet-expert.com/insulinoterapiya/obshhie-svedeniya/insulin-chelovecheskij-genno-inzhenernyj-254

Современные технологии получения инсулина для лечения сахарного диабета

Сахарный диабет (СД) – одно из самых грозных и распространенных заболеваний обменного характера. По данным статистики, через каждые 10-15 лет числом больным диабетом в мире удваивается.

Болезнь негативно отражается на качестве жизни. Больной постоянно испытывает сухость во рту и жажду, поэтому вынужден употреблять большое количество жидкости. В результате развивается частое и обильное мочеиспускание. Человек испытывает повышенный аппетит. Кожа становится сухой, на ней появляются гнойнички. Часто наблюдаются судороги икроножных мышц.

Со временем происходит поражение сердца и сосудов, периферических нервов, сетчатки глаз, почек, образование трофических язв (диабетическая стопа), резко возрастает риск впадения в диабетическую кому.

Типы заболевания и их причины

СД бывает двух основных типов:

первого,
второго.

Первый тип развивается чаще всего в молодом возрасте (до 30 лет). Связан он с недостаточной секрецией гормона инсулина, который вырабатывается поджелудочной железой (ПЖ). Снижение производства гормона происходит из-за повреждения β-клеток островков Лангерганса ПЖ. Они повреждаются в результате аутоиммунной реакции организма на некоторые вирусные инфекции (гепатит, краснуха, паротит) или токсического действия пестицидов, нитрозаминов, лекарственных препаратов и т.д.

Диабет второго типа обычно начинается после сорока лет. Уровень гормона в крови в этом случае может быть нормальным или даже превышать норму, однако клетки организма оказываются невосприимчивыми к нему. Причин СД 2-го типа много (наследственная предрасположенность, ожирение, хронический стресс, систематические нарушения в питании и т.д.).

При диабете обоих типов в крови диагностируется повышенное содержание глюкозы.

Лечение

Современная медицина не умеет излечивать СД, поэтому лечиться от этого хронического заболевания придется всю оставшуюся жизнь. Поддерживающая терапия проводится по двум ключевым направлениям:

соблюдение диеты, направленной на повышение сахара в крови,
прием гормона или сахаропонижающих препаратов для регулирования углеводного обмена.

При СД 1-го типа, его называют инсулинзависимым, без инсулинотерапии не обойтись.

Во втором случае (инсулиннезависимый СД) основной упор делается на диету и прием лекарств, снижающих сахар. Инсулинотерапия прописывается при неэффективности применения лекарств, понижающих уровень сахара, развитии кетоацидоза и прекоматозного состояния. Инсулинотерапия проводится также при наличии сопутствующих патологий (печеночная и почечная недостаточность, туберкулез, хронический пиелонефрит).

Получение инсулина

Представляет собой инсулин гормон пептидной природы. Молекулу формируют две полипептидные цепи. Первая из них (А) включается в себя 21 аминокислотный остаток, вторая (В) – 30 остатков. Соединены цепи между собой двумя дисульфидными мостиками.

Главная роль гормона заключается в регулировке обмена углеводов. Гормон усиливает переход глюкозы через клеточные мембраны и утилизацию ее тканями, содействует трансформации в гликоген в печени. Он также подавляет расщепление гликогена до глюкозы и ее синтез из аминокислот и жирных кислот.

Помимо углеводного, гормон участвует в белковом и жировом обмене.

Впервые в истории человечества СД попробовали лечить в 1922 году гормоном, выделенным из ПЖ телят. Эксперимент удался со второй попытки.

В настоящее время используются два способа промышленного производства препаратов для диабетиков:

ферментативная обработка свиного инсулина,
генно-инженерный.

Гормон у свиней отличается от человеческого всего на одну аминокислоту – вместо треонина присутствует аланин. Поэтому чтобы придать ему структуру человеческого, производят химическую модификацию животного сырья. В процессе химической реакции отщепляют аланин и присоединяют треонин.

При генно-инженерном способе для выпуска средства используются генетически измененные микроорганизмы (бактерии, дрожжи). Имеются два варианта производства подобного инсулина.

Первый вариант предполагает применение двух штаммов какого-то микроорганизма. Каждый из штаммов синтезирует одну цепь молекулы ДНК. Потом две цепи соединяются, после чего из раствора выделяются активные формы инсулина.
Суть второго варианта состоит в том, что микроорганизм сначала производит проинсулин. После обработки ферментами проинсулин превращается в активный гормон.

В инсулиновых препаратах, если они не прошли надлежащую очистку, могут присутствовать различные примеси, способные вызывать нежелательные побочные эффекты.

К таким примесям относятся проинсулин, белки, глюкагон и т.д. Современные технологии очистки, при их соблюдении, позволяют производить очищенные (монопиковые) и высокоочищенные (монокомпонентные, кристаллизованные) инсулины.

Классификация по длительности воздействия

По этому критерию различают инсулиновые препараты:

ультракороткого действия (УКД),

короткого КД),
среднего (СД),
длительного (ДД),
комбинированного действия.

Как известно, секреция инсулина в норме варьируется, т.е. в течение суток он вырабатывается неравномерно. Различают фоновую (базальную) и стимулированную выработку гормона. Базальной является та, которая существует в организме без влияния внешних стимулов для выделения гормона, например, приема глюкозы. Ее роль заключается в том, что она снижает:

базальный выпуск глюкозы печенью,
уровень сахара натощак,
уровень свободных жирных кислот.

Препараты КД и УКД заменяют инсулин, который секретирует ПЖ в ответ на внешний стимул. Препараты СД и ДД создают фоновую секрецию. Препараты комбинированного вида совмещают оба действия.

Инсулины УКД

При подкожном введении (п/к) препарата УКД эффект снижения сахара проявляется быстро , в среднем через четверть часа. Своего пика содержание гормона достигает в течение одного-трех часов. Длительность действия не превышает пяти часов. К таким лекарствам относятся инсулины лизпро, аспарт, глулизин.

Лизпро представляет собой ДНК-рекомбинантный аналог человеческого гормона, полученный путем перестановки двух аминокислот в молекуле. Реализуется под торговой маркой «Хумалог».

Для получения аспарта убирают аминокислоту пролин и вставляют вместо нее аспаргиновую кислоту. Продается лекарство под названиями «НовоРапид Пенфилл» и т.д.

При производстве глулизина аспаргин (аминокислота) заменяется аминокислотой лизин, а лизин в другой позиции на глутаминовую кислоту. Торговая марка – «Апидра».

Применять инсулины УКД можно непосредственно перед едой.

Инсулины КД

Эти инсулины также называют растворимыми, поскольку они являются буферными растворами с нейтральным рН (6,6- 8). Как правило, их используют в условиях стационара, когда требуется быстро снизить содержание глюкозы при диабетической коме и прекоме, а также при установлении оптимальной дозы для пациента.

Результат при подкожной инъекции наступает через 30 мин., эффект максимальной величины достигает через 120 мин., длится около шести часов. Вводят препараты КД также внутривенно и внутримышечно. Растворимые инсулины производятся следующих видов:

человеческий генно-инженерный,

человеческий полусинтетический,
свиной монокомпонентный.
К первому виду относятся «Хумулин Регуляр» и т.д.

К полусинтетическим средствам принадлежат «Биосулин Р» и т.д.

В список монокомпонентных свиных препаратов входят «Актрапид МС» и т.д.

Инсулины СД

Они медленнее всасываются, чем предыдущие препараты, поэтому обладают более длительным воздействием. Терапевтический эффект после приема проявляется приблизительно через 90-120 минут, продолжается он от восьми до двенадцати часов.

Эти препараты содержат пролонгатор – протамин (белок, полученный из молок рыб) или цинк. НПХ-инсулин (изофан, нейтральный протамин Хагедорна) является суспензией из протамина и инсулина.

Инсулин-изофан бывает человеческим полусинтетическим и полученным методами генной инженерии, а также свиным. Реализуются препараты под такими марками: «Монодар Б», «Гансулин Н», «Биосулин Н» и т.д.

Инсулин-цинк суспензию составную можно приобрести под названием «Монотард МС».

Инсулины ДД

К ним относятся гларгин («Лантус») и детемир («Левемир Пенфилл» и т.д.).

Гларгин получают при помощи двух преобразований молекулы гормона. В А-цепи аспаргин в позиции 21 заменяется глицином, в В-цепи остатки аргинина присоединяются к С-концу.

Детемир производится методом биотехнологии рекомбинантной ДНК при использовании одноклеточных микроскопических грибков из класса сахаромицетов.

Длительность воздействия этих препаратов может достигать 36 часов. Начинается эффект после применения через четыре-восемь часов.

Эти препараты не имеют выраженного пика действия, т.е. промежутка времени, когда в крови пациента наблюдается максимальная концентрация гормона. Подобный эффект достигается за счет высвобождения в кровь действующего вещества с постоянной скоростью.

Подобные препараты удобные тем, что позволяют обеспечить гликемический контроль в течение суток за счет одного укола. Выпускаются лекарства в виде суспензий, которые вводятся внутримышечно или подкожно.

Препараты ДД не используют, когда больной находится в прекоме или коме. Они имеют кислый рН, поэтому их нельзя применять вместе с лекарствами КД, у которых нейтральная кислотность.

Препараты комбинированные

Препараты являются суспензиями, которые состоят из инсулина КД и СД. Это сочетание позволяет обойтись одной инъекцией, если есть необходимость применения двух типов лекарств.

Бифазные препараты дают гипогликемический эффект минут через тридцать после укола под кожу. Длительность эффекта достигает двадцати часов. Эти лекарства продаются под названиями «Биогулин 70/30» и т.д.

Вспомогательные компоненты

Помимо активного вещества, препараты инсулина содержат различные вспомогательные элементы. Они имеют не терапевтическое, а технологическое значение.

К ним относятся:

пролонгаторы,
антимикробные компоненты,
стабилизаторы.

Первые предназначены для увеличения длительности действия активного компонента.

Антимикробные вещества продлевают срок службы препарата, предотвращая развитие микроорганизмов.

Стабилизаторы сохраняют постоянным уровень кислотности препарата.

Комплекс применяемых дополнительных веществ не одинаков в различных препаратах.

Инсулин оказывает неоценимую помощь диабетикам. Но его необходимо правильно применять. Дозировка лекарства проводится врачом с учетом индивидуальных особенностей состояния пациента (уровня глюкозы, физической активности человека, калорийности рациона, реакции организма на инсулин и т.д.). Передозировка препарата опасна тем, что может резко снизиться содержание глюкозы в кровяном русле, в результате чего человек рискует впасть в гипогликемическую кому.

Дополнительную информацию о производстве инсулина можно получить из видеоматериала.

Узнать, как правильно делать инсулиновые инъекции, можно из видео.

Источник статьи: https://rvdku.ru/diabet/sovremennye-tehnologii-polucheniya-insulina-dlya-lecheniya-saharnogo-diabeta

Источник