Кишечная палочка в пробе воды

В разделе: Вода
2018-05-2424.05.2018

Вода является неотъемлемой составляющей всех живых систем. В среднем, человек потребляет 2,5 литра воды в день. Наряду с полезным кальцием, магнием и калием вода несет в себе и вредные для здоровья человека элементы, такие как нитраты, нитриты, кадмий и тому подобное. Характеристики употребляемой нами жидкости определяют качество и продолжительность жизни. Согласно докладу Всемирной организации здравоохранения (WHO, 2007), около 1,1 миллиарда человек не имеют доступа к безопасным источникам водоснабжения, а около 2 миллиона человек ежегодно умирают от заболеваний, передающихся через питьевую воду. Тошнота и диарея – не самое опасное, что вызывают микроорганизмы. Бактерии и вирусы в прямом смысле могут отравлять нашу жизнь, вызывая болезни с летальным исходом (например, Clostridium botulinum – возбудитель ботулизма) или опосредовано приводя к смертельным случаям (Helicobacter pylori – возможная причина рака ЖКТ). В Российской Федерации состояние воды регламентируются несколькими нормативами в зависимости от предназначения (смотреть таблицу).

Требования к микробиологическим показателям качества воды в Российской Федерации в зависимости от хозяйственной деятельности человека

1. СанПиН 2.1.5.980-00 «Гигиенические требования к охране поверхностных вод»
2. СанПиН 2.1.2.1188-03 «Плавательные бассейны. Гигиенические требования к устройству, эксплуатации и качеству воды. Контроль качества»
3. СанПиН 2.1.4.1175-02 «Гигиенические требования к качеству воды нецентрализованного водоснабжения. Санитарная охрана источников»
4. СанПиН 2.1.4.1074-01 «Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды централизованных систем питьевого водоснабжения. Контроль качества»
5. СанПиН 2.1.4.1116-02 «Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды, расфасованной в емкости. Контроль качества»

Оценка качества по микробиологическим показателям сводится к определению в объекте доли микроорганизмов, связанных с человеком и его продуктами жизнедеятельности.

Прежде всего, определим единицы измерения количества микробов. КОЕ/мл (колониеобразующие единицы) – количество жизнеспособных микробных клеток в миллилитре. Если производится оценка вирусных частиц в среде, то указывается БОЕ/мл (бляшкообразующие единицы) – количество вирусных частиц в миллилитре.

Общие показатели

Общая микробная численность бактерий (ОМЧ) базовый показатель

Выявляет бактерии, потенциально способные причинить вред здоровью. Этот показатель достаточно информативен, так как высокая ОМЧ является индикатором загрязнения органическими соединениями (например, содержащихся в фекалиях) и различными формами азота. С другой стороны, в ОМЧ входят как опасные бактерии (например, высокопатогенный штамм кишечной палочки Escherіchіa colі), так и практически безвредные и повсеместно встречаемые сенные палочки (Bacillus subtillis).

Общие колиформные бактерии (ОКБ) колодцы, скважины, родники

Группу ОКБ формируют бактерии семейства Enterobacteriacea (Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella). Многие представители этой группы относятся к нормальной микрофлоре желудка, поэтому превышение ОКБ может говорить о возможном фекальном загрязнении, связанном с деятельностью человека. Однако в данной группе могут встречаться и свободноживущие микробы, которые не представляют опасности для здоровья.

Термотолерантные колиформные бактерии (ТКБ) колодцы, скважины, родники

ТКБ – более достоверный индикатор загрязнения продуктами жизнедеятельности. Этот показатель свидетельствует о свежем фекальном загрязнении. В большинстве случаев в этой группе обнаруживается кишечная палочка Escherіchіa colі.

Колифаги колодцы, открытые источники

Колифаги являются вирусами палочки Escherichia coli и рассматриваются эпидемиологами как более чувствительный метод определения загрязнения жидкости микроорганизмами группы кишечной палочки. Вирусные частицы более устойчивы к окружающей среде, чем бактерии, в которых они обитают, поэтому этот показатель качества служит достоверной меткой давнего фекального загрязнения. Содержание колифагов свидетельствует о наличии опасных для человека энтеровирусов в воде.

Рекомендуется проводить исследование этой характеристики в случае, если ранее источник не был проверен, а также для оценки эффективности методов дезинфекции источников и систем подачи-распределения воды.

Споры сульфитредукторов бытовые нужды

Спорообразующие клостридии (Clostridium botulinum, Clostridium perfringens, Clostridium tetani) являются дополнительным микробиологическим показателем фекального загрязнения. Клостридии встречаются в кишечнике, однако при попадании в организм в большом количестве могут вызывать пищевые отравления и смертельные заболевания, в том числе, ботулизм. В отличие от относительно неустойчивых ОКБ и ТКБ, споры клостридий могут сохраняться долгое время, поэтому этот микробиологический показатель, как и колифаги, свидетельствует о наличии давнего загрязнения. Относительно высокая устойчивость позволяет использовать споры в качестве индикатора эффективности проведения водоподготовки (хлорирования, озонирования и т.п.).

Определение этого микробиологического показателя качества воды рекомендуется проводить при наличии посторонних запахов и образовании чёрного налёта на трубах, а также для оценки эффективности методов дезинфекции источников и систем подачи-распределения жидкости.

Синегнойная палочка бассейны, колодцы, родники

Pseudomonas aeruginosa – распространённый организм, который встречается практически во всех средах, в т. ч. входит в состав микрофлоры кожи. Однако при снижении иммунитета человека и высоком содержании в воде синегнойная палочка может вызывать серьёзные заболевания, поражая лёгкие и почки и приводя к сепсису. Присутствие Pseudomonas aeruginosa в бассейне или ванне является основанием для полной замены содержимого резервуара. Особенность синегнойной палочки – её чрезвычайная устойчивость к нагреванию, дезинфицирующим средствам и антибиотикам.

Золотистый стафилококк бассейны, колодцы, кулеры, родники

Staphylococcus aureus – тесно связанная с человеком бактерия, которая в основном образует колонии на коже, половых органах, респираторном и желудочно-кишечном трактах. Как и синегнойная палочка, золотистый стафилококк встречается у здоровых людей, однако может вызвать развитие болезни при ослаблении иммунитета.

Возбудители кишечных инфекций специфические показатели

В действующих нормативных документах не прописаны конкретные возбудители кишечных инфекций. В эту группу входят микроорганизмы, заражение которыми происходит через жидкие среды (Escherichia, Shigella, Vibrio, Salmonella). Процесс определения этого параметра трудоёмок и требует специальной квалификации микробиолога.

Микробиологические показатели качества воды, не регулируемые СанПиН

Развитие и удешевление технологий и новых методов приводит, с одной стороны, к расширению контролируемых параметров, с другой, к выбору более конкретных микроорганизмов-показателей. Например, руководство ВОЗ рекомендует использовать в качестве индикатора фекального загрязнения наличие кишечной палочки (Escherіchіa colі), а не ОКБ и ТКБ. В странах ЕС помимо палочки определяют наличие энтерококков – специфичной группы микроорганизмов обитателей кишечника человека. Ниже приведены группы микроорганизмов, которые имеют индикаторное значение при оценке микробиологического качества воды.

Энтерококки колодцы, скважины, родники

Enterococcus spp. – широкая группа микроорганизмов, проживающая в кишечнике человека. Наряду с золотистым стафилококком энтерококки являются причиной внутрибольничных инфекций, вызывают у человека (менингит, эндокардит). Ввиду более высокой устойчивости этих микроорганизмов к засолению и температуре, по сравнению с ТКБ, энтерококки – более надежный индикатор фекального загрязнения морей и солёных озёр. Согласно нормативу ЕС, эта группа не должна обнаруживаться в 250 мл. Согласно законодательству США, при превышении содержания Enterococcus spp. 35 КОЕ / 100 мл вводится запрет на купание людей.

Условно-патогенные дрожжи и микромицеты колодцы, родники, поверхностные воды

К условно-патогенным дрожжам и микромицетам (плесени) относят большую неоднородную группу грибных организмов. В неё входят Candida albicans и Cryptococcus neoformans, которые вызывают оппортунистические заболевания, в т. ч. грибковые заболевания кожи и молочницу. Другие организмы-микромицеты (Cladosporium cladosporioides, Aspergillus niger) усиливают аллергические реакции, а иногда вызывают их. Особенно опасны плесневые грибы (Penicillium spp., Aspergillus spp., Fusariam spp., Alternaria spp. and Claviceps spp), образующие канцерогенные микотоксины (патулин, афлотоксин). Исследователи из Европейского союза пришли к выводу, что водопроводная вода не является распространителем микотоксинов, однако в стоячих источниках (например, накопительных резервуарах) могут создаться условия для благоприятного развития грибов. В некоторых странах ЕС содержание грибов строго регламентируется, например, в Швеции в питьевой воде их не может быть более 100 КОЕ / 100 мл.

Сине-зелёные водоросли (цианобактерии) бытовые нужды, воды для купания, кормление животных

Микроорганизмы, содержащие зелёный пигмент хлорофилл – обитатели богатых питательными элементами стоячих водоемов. Сами микроорганизмы не заражают человека, но синтезируют и выделяют в среду цианотоксины, вызывающие поражение внутренних органов млекопитающих: гепатотоксины (Microcystis, Anabaena, Oscillatoria, Nodularia, Nostoc, Cylindrospermopsis и Umezakia), нейротоксины (Aphanizomenon и Oscilatoria), почечные токсины (Cylindroapermopsis raciborski).

Таким образом, микробиологические показатели качества воды отражают несколько важных показателей:

1. Общее загрязнение микроорганизмами источника воды (ОМЧ).
2. Наличие фекального загрязнения и продуктов жизнедеятельности (ОКБ, ТКБ, колифаги, сульфитредукторы, энтерококки).
3. Возможное наличие энтеровирусов (колифаги).
4. Наличие потенциально опасных микроорганизмов (золотистый стафилококк, синегнойная палочка, условно-патогенные дрожжи, энтерококки, сульфитредукторы).
5. Наличие потенциальных продуцентов микотоксинов и цианотоксинов (грибы и цианобактерии).
6. Наличие патогенных микроорганизмов (Shigella, Vibrio, Salmonella).

Санитарно-бактериологическое исследование воды – Ф. К. Черкес

Исследованию подлежит вода:

1) централизованного водоснабжения;

2) из колодцев различного типа;

3) открытых водоемов (рек, озер, морей);

4) плавательных бассейнов;

5) сточных вод.

Примечание. Пробы хлорированной воды берут во флаконы с дехлоратором (гипосульфитом).

Отбор проб воды. Из открытых водоемов воду берут с помощью специальных бутылей или батометров, снабженных грузилами. Пробу воды рекомендуют брать на глубине 10-15 см от поверхности (так как поверхность подвергается воздействию атмосферных факторов) и на расстоянии 1,5 м от берега (вода у самого берега может быть загрязнена микрофлорой почвы).

Для отбора проб водопроводной воды используют стерильные флаконы вместимостью 500 мл, закрытые ватно-марлевыми пробками и покрытые бумажными колпачками.

Кран предварительно обжигают тампоном, смоченным спиртом, после чего воду спускают в течение 10-15 мин и набирают во флаконы. Заполненные флаконы закрывают стерильными пробками.

Примечание. Исследуют 333 мл воды (табл. 54).

В распределительной сети водопровода отбор проб воды осуществляют в зависимости от количества населения, проживающего в зоне обслуживания.

Стандартные методы исследования регламентированы для воды центрального водоснабжения (ГОСТ 18963-73) и предусматривают:

1. Определение общего числа микроорганизмов (в 1 мл исследуемой воды должно быть не более 100).

2. Определение коли-индекса и коли-титра (коли-индекс 3, коли-титр 333 и выше; для Москвы и Ленинграда коли-индекс не более 2, а коли-титр более 500).

3. Исследование по эпидемиологическим показаниям на патогенную микрофлору (патогенных микроорганизмов не должно быть обнаружено).

Определение общего числа бактерий

Согласно ГОСТу 18963-73 общее число бактерий – это то количество микроорганизмов, которое содержится в 1 мл исследуемой воды, способных в течение суток при температуре 37° С образовывать колонии, видимые невооруженным глазом (или при увеличении с помощью лупы).

Первый день исследования

При исследовании водопроводной воды засевают 2 чашки. В одну из них вносят 1 мл неразведенной воды, в другую 1 мл воды, разведенной в 10 раз (т. е. 0,1 мл исходной пробы).

При исследовании более загрязненной воды засевают 1 мл воды, разведенной в 100 раз. Это соответствует 0,01 и 1 мл .воды, разведенной в 1000 раз (0,001 мл) и т. д. Для получения таких объемов готовят последовательно десятикратные разведения, по 1 мл каждого разведения вносят в чашку и заливают тонким слоем (12-15 мл) растопленного и остуженного до 45° С питательного агара. Для равномерного распределения исследуемой воды залитые агаром чашки перемешивают путем вращения их. После застывания агара посевы ставят в термостат и инкубируют при температуре 37° С 24 ч.

Второй день исследования

Чашки с посевами вынимают из термостата и подсчитывают число выросших колоний. Учитывают только те чашки, где число колоний находится в пределах 30-300. Если колоний немного, их подсчитывают невооруженным глазом или при помощи лупы.

Если колоний много, то подсчет можно вести с помощью специального прибора для счета микробных колоний (рис. 54).

Подсчитанное количество колоний умножают на разведение и узнают число микробов в 1 мл исследуемой воды.

Определение БГКП

Наличие БГКП (бактерий группы кишечной палочки) является показателем фекального загрязнения, интенсивность которого характеризуют:

Коли-индекс – количество кишечных палочек, обнаруженных в 1 л воды.

Коли-титр – наименьшее количество воды, в котором обнаруживают присутствие кишечной палочки*.

* ()

Для выявления в воде БГКП можно пользоваться двумя методами: титрационным (бродильным) и методом мембранных фильтров.

Титрационный метод

Для исследования воды используют среду накопления глюкозопептонную (ГПС) среду Эйкмана с индикатором и бродильными трубками. Среда готовится концентрированной (в 10 раз) и нормальной концентрации – для посева 1 мл воды.

Первый день исследования

Исследуемую воду засевают по 100 мл в 3 колбы, по 10 мл в 3 пробирки (с концентрированной средой) и по 1 мл в 3 пробирки (со средой нормальной концентрации) – всего 333 мл. Посевы инкубируют в термостате при 37° С 24 ч.

Второй день исследования

Вынимают посевы из термостата и просматривают их.

При наличии помутнения в колбах или пробирках из них производят посев петлей на сектора среды Эндо в чашках Петри. Посевы инкубируют в термостате при 37° С.

Третий день исследования

Вынимают чашки из термостата. Из подозрительных колоний делают мазки. При наличии грамотрицательных палочек ставят пробу на оксидазную активность. Положительная проба на оксидазу дает право дать отрицательный ответ.

Проба на оксидазу. 1-й способ: со среды Эндо снимают петлей 2-3 колонии каждого типа и наносят на поверхность фильтровальной бумаги, смоченной диметилпарафенилендиамином. Положительная реакция характеризуется посинением штрихов, сделанных из колоний.

2-й способ: реактив можно нанести на изолированную колонию на среде Эндо (красная колония – синеет) (рис. 55).

Отрицательная проба на оксидазу свидетельствует о наличии в воде БГКП. В этом случае вычисляют коли-индекс и коли-титр с помощью стандартных (эмпирических) таблиц ГОСТа 16963-73 (см. табл. 54).

Эти таблицы предусматривают любую возможную комбинацию объемов посева, из которых выделена кишечная палочка.

Метод мембранных фильтров

Для фильтрации воды можно использовать воронку Гольдмана вместимостью 700-800 мл.

Первый день исследования

В воронку смонтированного и простерилизованного фильтровального прибора Зейтца наливают отмеренный объем исследуемой воды. С помощью насоса создают вакуум в приемном сосуде (обычно воду фильтруют через фильтры № 2 и 3). По окончании фильтрации стерильным или обожженным в огне пинцетом снимают фильтр и накладывают его на среду Эндо в чашке Петри так, чтобы поверхность с осевшими на ней микробами была обращена вверх (на одну чашку можно помещать 3-4 мембранных фильтра).

Посевы инкубируют в термостате при температуре 37° С 18-24 ч.

Второй день исследования

Чашки с посевами (фильтрами) вынимают из термостата. Отсутствие подозрительных колоний дает право дать отрицательный ответ.

Учету подлежат все красные и розовые колонии с металлическим блеском или без него. Из выросших колоний делают мазки, окрашивают по Граму (рис. 56).

При наличии грамотрицательных палочек ставят пробу на оксидазу. Положительная оксидазная проба дает право дать отрицательный ответ. При отрицательной оксидазной пробе производят посев на полужидкую среду с глюкозой и индикатором или на среду ГПС с бродильными трубками – для выявления ферментации углевода до кислоты и газа. При наличии кислоты и газа вычисляют коли-индекс. Например, на всех фильтрах, находящихся на среде Эндо, выросло 3 колонии, пропущено через фильтр было 300 мл воды.

Расчет. 300 мл – 3 колонии
1000 мл – х
х = 10; коли-индекс 10

Примечание. Титрационный метод более точный и может быть использован при наличии в воде примесей. Метод мембранных фильтров экономичнее и дает возможность дать ответ на 2-й день.

Выявление свежего фекального загрязнения

Для определения наличия в воде свежих фекальных кишечных палочек производят посев воды (3-х объемов) на лактозопептонную среду с борной кислотой. Инкубируют при 43° С 24 ч. Наличие кислоты и газа свидетельствует о свежем фекальном загрязнении.

По эпидемиологическим показаниям в воде определяют сальмонеллы, шигеллы, энтеровирусы.

Примечание. Общепринятым дополнительным показателем фекального загрязнения питьевой воды являются энтерококки. При проведении бактериологического исследования определяют все группы энтерококков, хотя санитарное значение имеют преимущественно фекальные стрептококки, обнаружение которых является показателем свежего фекального загрязнения.

Контрольные вопросы

1. Какова основная задача санитарной микробиологии?

2. Что такое санитарно-показательные микроорганизмы?

3. Что такое коли-индекс и коли-титр?

4. Какие Вы знаете методы определения БГКП?

Задание

Определите общее число микробов в исследуемой пробе воды. Среда ГПС (Эйкмана).

Питательные среды

ГПС (Эйкмана) концентрированная. В 1 л воды растворяют 100 г пептона, 50 г хлорида натрия. Нагревают смесь до кипения, фильтруют, прибавляют 100 г глюкозы, устанавливают рН 7,4-7,6 и разливают по 10 мл в колбы вместимостью 250 мл, по 1 мл в 3 пробирки (концентрированной среды) и по 1 мл в 3 пробирки со средой нормальной концентрации (во всех емкостях среду до нужной концентрации доводят стерильной водой).

Примечание. При исследовании особенно загрязненных вод делают большие разведения (например, 10-6, 10-7 и т. д.).

lush bullet