Молекула фермента триптофансинтетазы кишечной палочки

Все клетки любого организма, какие бы функции они ни выполняли, имеют полный набор свойственных данному организму генов. Вместе с тем хорошо известно, что у любого организма клетки разных тканей и органов отличаются поразличным признакам и набору имеющихся в них белков. Даже в одной клетке на разных стадиях ее развития синтезируются и функционируют разные белки. Следовательно, располагая полной генетической информацией, каждая клетка на определенном этапе развития использует лишь ту ее часть, которая необходима в настоящий момент, транскрибируются только те гены, продукты которых нужны клетке в данный момент для осуществления ее функций. Следовательно, клетка должна располагать механизмами, определяющими, какие гены и в какой последовательности должны экспрессироваться (“выражаться”, то есть давать продукт — РНК или белок). Наиболее полно регуляция генной активности изучена на примерах адаптивного синтеза ферментов у прокариот. 

В зависимости от условий количество определенного фермента в бактериальной клетке может существенно изменяться. Некоторые ферменты, необходимые бактерии для усвоения определенных питательных веществ, активно синтезируются в клетке только тогда, когда эти вещества присутствуют в культурной среде, и синтез их прекращается, если каким-либо образом они удаляются из среды. Такой тип регуляции синтеза фермента называется индукцией, а вещество, включающее экспрессию гена — индуктором.

Активация и репрессия оперонов у бактерий 

лактозный оперон

Один из наиболее наглядных примеров данного типа регуляции — лактозный оперон кишечной палочки — группа генов, контролирующая синтез ферментов, осуществляющих катаболизм (расщепление) молочного сахара — лактозы. Буквально через несколько минут после добавления в питательную среду для кишечной палочки лактозы бактерии начинают вырабатывать три фермента: галактозидпермеазу, бета-галактозидазу и галактозидтрансацетилазу. Как только ресурсы лактозы в среде исчерпываются, синтез ферментов сразу же прекращается.

Приведенный пример станет более понятным при рассмотрении схемы работы лактозного оперона, изучение которого позволило французским ученым Ф. Жакобу и Ж. Моно разработать собственно концепцию оперона и выяснить основные принципы регуляции транскрипции у прокариотов.
Оперон — это группа генов прокариот, находящихся под общим промотором. Все эти гены транскрибируются на одну общую молекулу мРНК. Такая мРНК, содержащая информацию о нескольких белках, называется полицистронной. Участок ДНК или РНК, содержащий информацию об одном белке, называется цистроном.

Лактозный оперон начинается с регуляторного участка, предназначенного для присоединения белка-активатора, в свою очередь необходимого для присоединения к следующему за этим участком промотору (П) РНК-полимеразы. Последовательность нуклеотидов промотора узнаётся РНК-полимеразой.

С промотором перекрывается следующий участок — оператор (О). С ним может связываться регуляторный белок-репрессор. Репрессор блокирует промотор и тем самым предотвращает транскрипцию гена.

За оператором следуют структурные гены для трех упомянутых ранее ферментов. Заканчивается оперон терминатором, прекращающим продвижение РНК-полимеразы и транскрипцию оперона.

Регуляторный белок-репрессор в незначительном количестве синтезируется в клетке постоянно, так что в цитоплазме одновременно присутствует не более 10 его молекул. Этот белок обладает сродством к последовательности нуклеотидов в области оператора и сродством к лактозе.

В отсутствие лактозы белок-репрессор связывается с операторным участком и препятствует продвижению по ДНК РНК-полимеразы: не синтезируется мРНК, не синтезируются и ферменты. После добавления в среду лактозы белок-репрессор связывается с нею быстрее, чем с операторным участком. В результате последний остается свободным и не препятствует продвижению РНК-полимеразы. Идет транскрипция и трансляция. Синтезирующиеся ферменты осуществляют транспорт в клетку и расщепление лактозы. После того как вся лактоза будет израсходована, нечем станет связывать белок-реп рессор и он снова свяжется с оператором, прекратив транскрипцию оперона. Таким образом, индукция оперона вызывается тем, что регуляторный белок не прикрепляется к оператору. Такой тип индукции называется негативным.

Параллельно наблюдается и другой тип регуляции — позитивная регуляция. При глюкозном голодании в клетке из АТФ образуется сигнальное вещество цАМФ, которое связывается с белком-активатором (САР), после чего последний приобретает способность связывать ДНК в промоторной области и усиливать транскрипцию лактозного оперона. Таким образом, когда не хватает глюкозы, стимулируется всасывание и катаболизм лактозы. При одновременном присутствии глюкозы и лактозы последняя не метаболизируется, пока существенно не упадёт концентрация глюкозы.

триптофановый оперон

В случае индукции лактозного оперона аллолактоза (индуктор) препятствует присоединению белка-репрессора к оператору, то возможен и другой вариант регуляции, когда, наоборот, индуктор придает регуляторному белку способность присоединяться к оператору. Если в первом случае соединение индуктора с белком-регулятором разрешало транскрипцию, то во втором оно запрещает ее.

Примером такой регуляции может служить хорошо изученный триптофановый оперон кишечной палочки. В его состав входят пять структурных генов, обеспечивающих синтез аминокислоты триптофана, оператор и промотор. Репрессор синтезируется вне триптофанового оперона. Пока клетка успевает расходовать весь синтезирующийся триптофан, оперон работает, синтез триптофана продолжается. Если же в клетке появляется избыток триптофана, он соединяется с репрессором и изменяет его таким образом, что этот белок связывается с оператором. Комплекс репрессора с триптофаном взаимодействует с оператором и препятствует транскрипции структурных генов, вследствие чего синтез триптофана прекращается. В отсутствие триптофана репрессор лишается способности связываться с оператором, и происходит транскрипция структурных генов оперона и, в итоге, синтез триптофана в клетке.

Другой уровень регуляции триптофанового оперона включает аттенуацию — тонкую подстройку количества продукта в зависимости от концентрации присутствующего триптофана.

регуляция генов бактериофагов

Описанные типы регуляций характеризуют механизмы регуляции отдельных оперонов, практически не касаясь регуляции экспрессии генома в целом, в то время как совершенно очевидно, что регуляция разных оперонов должна носить согласованный характер. Такой согласованный характер работы разных оперонов и генов получил у вирусов и фагов название каскадной регуляции. Согласно принципу каскадной регуляции сначала происходит транскрипция «предранних», затем «ранних» и наконец «поздних» генов в зависимости от того, какие белки требуются на разных стадиях вирусной (фаговой) инфекции.

Конечно, принцип каскадной регуляции у фагов относится к наиболее простым. У более сложно организованных организмов для осуществления большого количества функций, происходящих одновременно или с определенной последовательностью, необходима согласованная работа многих генов и оперонов. Особенно это касается эукариотов, отличающихся не только более сложной организацией генома, но и многими другими особенностями механизмов регуляции генной активности.

регуляция генов эукариот

По принципам регуляции гены эукариотов можно условно разделить на три группы: 1) функционирующие во всех клетках организма; 2) функционирующие только в тканях одного типа; 3) обеспечивающие выполнение специализированными клетками конкретных функций.

Механизмы регуляции экспрессии генов у эукариот:

1. У эукариот известна регуляция генной активности на уровне структуры хроматина. В регуляции генов эукариот важную роль играют гистоны — основные белки, входящие в состав хромосом. Одни модификации гистонов характерны для активно работающих генов, другие — для молчащих. Существуют также вариантные гистоны, закодированные особыми генами. Они могут заменять “обычные” гистоны в определенных хроматиновых контекстах, влияя на регуляцию генов. 
   

   На электронных микрофотографиях в ядрах неделящихся клеток эукариот видны более плотно упакованные участки — гетерохроматин — и более рыхлые участки, называемые эухроматином. Гетерохроматин содержит центромерные и теломерные участки хромосом (облигатный гетерохроматин) и молчащие гены (факультативный гетерохроматин), а эухроматин — активно работающие гены.

2. Также распространенным типом регуляции экспрессии генов у эукариот является метилирование ДНК, в основном по 5 положению цитозина. Метилированная ДНК, как правило, присутствует в выключенных генах. Этим, в частности, объясняется трудность организменного клонирования, связанная с тем, что в соматических клетках (клетках тела) многие гены метилированы, поэтому когда ядром соматической клетки замещают ядро зиготы, экспрессия этих генов зачастую не активируется, т.к. метилирование генов не снимается. Надо отметить, что регуляторное метилирование распространено не у всех эукариот, например, оно не характерно для генома мушки дрозофилы.

   метилирование и горячие точки мутирования

   Поскольку метилированный цитозин при спонтанном дезаминировании, которое постоянно происходит в клетках, превращается в тимин, метилированные участки становятся горячими точками мутирования (Г-Ц-пара может превратиться в А-Т-пару).

3. Еще одним существенным отличием транскрипции у эукариотов является то, что многие мРНК длительное время сохраняются в клетке в виде особых частиц— информосом, в то время как мРНК прокариотов практически еще в процессе транскрипции поступают в рибосомы, транслируются, после чего быстро разрушаются. У эукариот развита регуляция экспрессии на уровне стабильности (времени жизни), трансляционной активности, локализации мРНК.

4. У эукариот известны и другие типы регуляции активности генов, такие, как эффект положения или дозовая компенсация. В первом случае речь идет об изменении генной активности в зависимости от конкретного окружения: перемещение гена из одного места хромосомы в другое может приводить к изменению активности как этого гена, так и близлежащих. Во втором случае нехватка одной дозы какого-либо гена (в первую очередь это относится к генам, локализованным в половых хромосомах гетерогаметного пола, когда одна из гомологичных половых хромосом либо генетически инертна, либо полностью отсутствует) фенотипически не проявляется за счет компенсаторного увеличения активности оставшегося гена. В целом же регуляция активности генов у эукариот в настоящее время активно изучается.

5. Вместе с тем имеется много данных, указывающие, что транскрипция определенных генов эукариот также может осуществляться скоординированно. Энхансеры — активирующие элементы в ДНК эукариот — могут действовать на огромных расстояниях, в десятки и сотни тысяч пар нуклеотидов. Предполагается, что это происходит путем образования хроматиновых петелль. Энхансер может действовать на целую группу генов; распространение действия энхансеров блокируется элементами-инсуляторами. Возможно, один энхансер активирует один петлевой домен ДНК — участок ДНК, формирующий одну хромомерную петлю и содержащий совместно регулирующиеся гены. Однако далеко не всегда совместно регулирующиеся гены у эукариот расположены рядом; трудно доказать и гипотезу петлевых доменов в связи со сложностями их картирования.

   
   А — активация генов энхансерами внутри одного петлевого домена, В — активация генов в разных доменах, разграниченных инсулятором.