Недостатки кишечной палочки как рекомбинантного продуцента
343. Рекомбинантные белковые гормоны и факторы неспецифического иммунитета имеют, по сравнению с выделяемыми из животного сырья, преимущества за счет:
а) большей биологической активности
б) большей стабильности
в) большей рентабельности и производства
г) видоспецифичности +
344. Преимуществом генно-инженерного инсулина является его:
а) высокая активность
б) меньшая аллергенность +
в) меньшая токсичность
г) большая стабильность
345. Молекула инсулина свиней отличается от молекулы человеческого инсулина следующим:
а) тремя аминокислотами
б) одной аминокислотой +
в) наличием дисульфидных мостиков
г) количеством полипептидных цепей
346. Инсулин состоит из:
а) 3-х полипептидных цепей
б) 2-х полипептидных цепей +
в) 2-х дисульфидных мостиков
г) 3-х дисульфидных мостиков
347. В молекуле свиного инсулина в 30-м положении β-цепи содержится: (в свином – аланин, в человеческом – треонин)
а) фенилаланин
б) аланин +
в) лейцин
г) треонин
348. Длительность действия лекарственных препаратов инсулина зависит от:
а) количества ионов инсулина
б) размеров кристаллов инсулина +
в) наличие аморфного инсулина
г) количества консерванта нипагина и фенола
349. Проинсулин – это белок, который состоит: из 3 цепей А В С.
а) из 2-х молекул инсулина
б) из 84-х аминокислотных остатков +
в) из инсулина и инсулиноподобных белков
г) из 4-х молекул инсулина
350. Монокомпонентный инсулин получают методом:
а) гель-хроматографии
б) ионообменной хроматографии
в) гидрофобной хроматографии
г) аффинной хроматографии +
351. E. coli в качестве продуцента рекомбинантного инсулина используют благодаря: каждая цепь синтезируется в отд культуре эшерихии на основе уже созданной последовательности 2 его цепей, которые кодируется генами человека.
а) детальной изученности +
б) способности к сплайсингу
в) способности образовывать дисульфидные связи
г) способности депонировать цепи А и В инсулина внутри клеток
352. Кишечная палочка как рекомбинантный продуцент для производства человеческого инсулина продуцирует:
а) человеческий инсулин с правильной укладкой дисульфидных мостиков
б) проинсулин с правильной укладкой дисульфидных мостиков
в) отдельно цепи А и В инсулина +
г) продуцирование внеклеточных метаболитов
353. Дрожжи-сахаромицеты синтезируют рекомбинантный человеческий инсулин в виде: Проинсулина https://health.orgsystem.ru/src/lib/1756_1307602455.pdf
354. Метод получения генов цепей А и В инсулина: Химико-ферментный синтез
355. Метод получения гена проинсулина: Химико-ферментный синтез, синтезируется в шероховатом эндоплазматич ретикилуме бета-клеток островков лангерганса пожделудочной железы.
356. Инсулин образует стойкие комплексы с ионами:
а) магния
б) цинка +
в) кальция
г) натрия
357. В производстве рекомбинантных β- и γ-интерферонов используют эукариотические продуценты благодаря их способности осуществлять:
а) сплайсинг
б) процессинг
в) продуцирование внеклеточных метаболитов
г) гликозилирование белков +
358. Активность α-интерферона определяется по защитному противовирусному действию на культуру клеток:
а) яичников китайского хомячка
б) эмбрионов человека +
в) печени обезьяны
г) куринной эмбриональной ткани
359. Выделение и очистку интерферонов осуществляют методом:
а) гель-хроматографии
б) аффинной хроматографии +
в) ионнообменной хроматографии
г) адсорбционной хроматографии
360. В качестве лигандов в аффинной хроматографии интерферонов используют: моноклональные антитела
361. Природный α-интерферон иначе называется: Лейкоцитарный (Лимфобластоидный)
362. Природный β-интерферон иначе называется: Фибробластный
363. Препараты природных интерферонов: Интерферон альфа, интерферон бета, интерферон альфаNl, Интерферон лейкоцитарный человеческий сухой, Интерферон человеческий лейкоцитарный д/ин., Интерферон человеческий лейкоцитарный в свечах, Лейкинферон, Локферон
364. Препараты рекомбинантных интерферонов: ЛП α-ИФН: Виферон, Реаферон, Гриппферон; ЛП β-ИФН: Бетаферон, Анаферон
365. Препаратом рекомбинантного β-интерферона является: интерферон бета−1a, вырабатываемый клетками млекопитающих (культура клеток яичника китайского хомячка), Бетаферон, Анаферон
366. Основные клетки-продуценты α-интерферона: стимулированными моноцитами и В-лимфоцитами человека
367. Ген соматотропина получают методом: Ферментный синтез или микробиологического синтеза??
368. Ген соматостатина получают методом: Химико-ферментный синтез
369. Промышленным источником препаратов эритропоэтина являются: Экспрессия гена в культуре животных клеток
370. Препараты соматотропина получают: Ферментативный метод на основе мРНК
Date: 2015-08-24; view: 2800; Нарушение авторских прав
Источник
Открытие российских ученых позволит затормозить распространение «супербактерий»
Биологи выяснили, как кишечная палочка и некоторые другие микробы производят мощнейшие антибиотики из класса микроцинов, убивающие сальмонеллу, возбудителей пневмонии и многих других опасных бактерий. Их выводы были представлены в журнале Molecular Cell.
Наше открытие позволит собирать не только антибиотики, но и другие белковые молекулы, способные бороться с раком и другими болезнями. Используя подобные молекулярные машины и короткие пептиды, можно собрать целый ворох новых лекарств
пояснил Константин Северинов, профессор “Сколтеха” и университета Ратгерс (США)
В последние годы перед медиками все шире и острее становится проблема появления так называемых “супербактерий” – микробов, стойких к действию одного или нескольких антибиотиков.
Среди них есть как редкие бактерии, так и очень распространенные и опасные патогены, такие как золотистый стафилококк или пневмококк. Возникла реальная опасность того, что все антибиотики потеряют свою эффективность и медицина вернется в “темные века”. Поэтому ученые сегодня начали искать антибиотики и похожие на них молекулы в самых неожиданных местах.
К примеру, в начале 2016 года китайские биологи рассказали о том, что им удалось найти новые антибиотики в желудке гусениц хлопчатниковой совки, чьи бактерии-симбионты помогают насекомому защищаться от инфекций, производя токсины, убивающие других бактерий. Аналогичные молекулы были найдены в крови опарышей, варанов и крокодилов.
Ученые, как отмечают Северинов и его коллеги, уже почти век знают, что похожие вещества, так называемые микроцины, производят многие бактерии, в том числе и обычная кишечная палочка. Они используют эти короткие белковые молекулы для “расчистки жизненного пространства” и уничтожения похожих на них микробов, не обладающих защитой от подобных токсинов.
Несмотря на массу интересных и полезных свойств, микроцины пока не проникли в медицину по одной простой причине – биологи не понимали того, как именно работает фермент McbBCD, собирающий их молекулы. Российские и зарубежные ученые нашли ответ на этот вопрос, получив точную трехмерную фотографию этого вещества при помощи ускорителя частиц.
Оказалось, что оно одновременно запускает и ускоряет сразу две цепочки реакций, необходимых для превращения коротких белковых заготовок микроцинов, не способных причинить вреда “врагам” бактерии, в “боевую” версию антибиотика.
Раскрытие механизмов работы McbBCD, по словам биологов, позволяет превратить его в своеобразный “конструктор” антибиотиков, произвольным образом меняя их структуру и создавая новые типы микроцинов и похожих на них молекул из пептидов разных типов.
Это, как надеются ученые, позволит человечеству затормозить распространение “супербактерий” и не проиграть гонку вооружений с ними. Вдобавок, эти опыты помогут создать более избирательные версии микроцинов, способные проникать в раковые клетки и замедлять их деление, что решит еще одну большую проблему современной медицины.
Понравилась статья? Ставьте лайк ???? и подписывайтесь ???? на наш канал!
—-
Читайте также:
Кошачья услуга
Рецепт на простое счастье
Социальная изоляция — «новое курение»?
—-
Канал ФОМ(Фонд Общественное Мнение) про политику, социологию, науку, культуру, этнографию, здоровье и многое другое. Если у вас есть интересные темы для публикаций или истории, которыми вы хотели бы поделиться, то напишите нам об этом: hello@fom.ru
Источник
Проблема антибиотикорезистентности. Бета-лактамазы расширенного спектра действия (БЛРС)В настоящее время четко определены основные серьезные проблемы, связанные с антибиотикорезистентностью бактерий, ответственных за развитие НКИ: MRS A, MRS-КНС, VRE, штаммы грамотрицатсльных палочек, продуцирующих БЛРС (Klebsiella pneumoniae и Е. Coli), мультирезистентные и папрезистентные штаммы энтеробактерий, неферментирующих грамотрицательных палочек А. baumannii и P. aeruginosa, появление штаммов стафилококков и энтерококков, резистентных к ванкомицину и линезолиду (Guideline for Isolation Precautions: Preventing Transmission of Infectious Agents in Healthcare Settings Recommendations of the Healthcare Infection Control Practices). Термины “мультрезистентность” (МDR, резистентность бактерии к трем классам антибиотиков и более), «экстенсивная или чрезвычайно высокая резистентность» (XDR, резистентность бактерии ко всем классам антибиотиков кроме одного или двух классов) и «панрезистентность» (PDR, резистентность бактерии ко всем классам антибиотиков) все чаще используются в литературе для описания различного уровня антим и кробной резистентности бактерий. Ключевая роль лаборатории клинической микробиологии состоит в своевременном и точном выявлении MDR у микроорганизмов, представляющих возбудителей НКИ. Существуют различные доступные в настоящее время методы диагностики резистентности (стенотипический, молекулярный, микробиологические анализаторы MDR, составляет 19 и 33% соответственно. Назначение хиполонов и антипсевдомонадных пенициллинов служит независимым фактором риска резистентности к карбапенемам у зитеробактерий. Инфекции, вызванные штаммами PDR-Enterobacteriaceае, связаны с высокой летальностью. Общая летальность при PDR-К. pneumoniae составляет 100% с атрибутивной летальностью 25 %. К. pneumoniae в последние годы считают наиболее «проблемным» микроорганизмом из семейства Enterobacteriaceae, у которого часто выявляется XDR или даже PDR. По нашим данным, Е. coli, К. pneumoniae и Е. cloacae — это основные виды грамотрицательных палочек из семейства зитеробактерий, которые вызывают послеоперационные РИ у онкологических больных. Все три вида имеют свои особенности, которые необходимо учитывать при назначении антибактериальных препаратов.
При определении чувствительности грамотрицательных палочек семейства Enterobacteriaceae весьма важен поиск штаммов, способных вырабатывать ферменты, объединенные в группу бета-лактамаз расширенного действия (БЛРС). Инфекции, обусловленные микроорганизмами, продуцирующими такие ферменты, поддаются терапии ограниченным количеством антимикробных препаратов. Обоснованные рекомендации по выявлению БЛРС фенотипическими методами распространяются только на штаммы Klebsiella spp. и Е. coli. Выработка БЛРС может быть выявлена практически у всех видов этого семейства и даже у целого ряда других грамотрицательных палочек. Продуценты бета-лактамаз расширенного действия (БЛРС) устойчивы ко всем пенициллинам, цефалоспоринам и монобактамам, даже когда in vitro эти препараты эффективны, Существуют различные методы выявления микроорганизмов, вырабатывающих бета-лактамаз расширенного действия (БЛРС), доступные практическим лабораториям. Ориентировочно можно предположить способность грамотрицательных палочек к продукции бета-лактамаз расширенного действия (БЛРС), если in vitro отмечается снижение чувствительности к таким препаратам, как цефподоксим, цефтазидим, цефтриаксон, цефотаксим или азтреонам. Далее, при выявлении подавления действия b-лактамаз ингибиторами (например, сульбактамом, клавулановой кислотой, тазобактамом) можно утверждать, что данный штамм вырабатывает БЛРС (CLSI, M100-S18, 2003). При выявлении продуцентов бета-лактамаз расширенного действия (БЛРС) препаратами выбора служат карбапенемы (имипенем, меропенем). Доля продуцентов бета-лактамаз расширенного действия (БЛРС) у пациентов хирургических отделений отечественных стационаров высока и примерно одинакова как для К.pneumoniae (46,2 %), так и для Е. coli (48,2%). По данным мониторинга антибиотикорезистентности в Европе при НКИ за 2005 2008 гг. (SMART), БЛРС — продуценты Е. coli составляют 10,8% (298 из 2764 штаммов), К. pneumoniae – 19,3% (128 из 662), что статистически значимо ниже частоты выделения подобных штам мов в отечственных клиниках. Следует отметить высокую чувствительность всех штаммов энтеробактерий отечественных клиниках к карбаненемам. При этом к имипенему отмечается более низкая по сравнению с меропенемом чувствительность, особенно в группе Proteus spp., где чувствительность к меропенему достоверно выше по сравнению с имипенемом (97,7% против 54,2% соответственно). In vitro чувствительность энтеробактерий к препаратам группы аминогликозидов от 30 до 100% и весьма зависит не только от рода, по и от вида энтеробактерий, что подтверждает необходимость организации микробиологических исследований на высоком уровне, который может быть обеспечен в современных условиях. Такие же выводы можно сделать и в отношении фторх и полонов (ципрофлоксацин, левофлоксацин). В крупных международных исследованиях отмечается высокий процент устойчивых к ципрофлоксацину штаммов E. coli, что наблюдается и в отечественных клиниках: около половины штаммов кишечной палочки устойчивы к ципрофлоксаципу. Многофакторный анализ показал, что профилактика фторхиполопами достоверно связана с увеличением устойчивости микроорганизмов к фторхинолонам и с продукцией БЛРС Е. coli. Кроме того, монотерапия фторхинолонами в сравнении со всеми другими антимикробными препаратами статистически значимо чаще связана с развитием бактериемии на фоне антибиотикотерапии (так называемая «бактериемия прорыва» — breakthrough bacteriemia), обусловленной P. aeruginosa, Е. coli, а также MRSA. – Также рекомендуем “Синегнойная палочка (P. aeruginosa) как причина раневых инфекций. Антибиотикорезистентность” Оглавление темы “Возбудители и лечение послеоперационных раневых инфекций”:
|
Источник
Формула изобретения
Штамм бактерий Escherichia coli BL21[DE3]pET151FliC – продуцент биологически активного рекомбинантного флагеллина, полученный трансформацией культуры клеток E. coli BL21[DE3] рекомбинантной плазмидной ДНК рЕТ151FliC, полученной на основе вектора рЕТ151FliC, в который был встроен ген fliC, кодирующий биологически активный флагеллин, имеющий нуклеотидную последовательность, представленную в Seq ID No 3, депонированный во Всероссийскую коллекцию промышленных микроорганизмов (ВКПМ) ФГУП ГосНИИГенетика под № В-11369.
Описание изобретения к патенту
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к технологии получения рекомбинантного флагеллина с помощью штамма бактерий Escherichia coli.
Бактериальный белок флагеллин является эффективным стимулятором иммунной системы. Взаимодействуя с клеточным рецептором TLR-5, который экспрессируется на поверхности клеток эпителия, эндотелия сосудов, нейтрофилов, моноцитов, дендритных клеток и Т-лимфоцитов, флагеллин вызывает быструю продукцию клетками противовоспалительных цитокинов и хемакинов, активирующих иммунные клетки и привлекающих их к месту внедрения патогена. Особую роль в развитии иммунного ответа играет взаимодействие флагеллина с TLR-5 дендритных клеток, стимулирующее созревание дендритных клеток, выражающееся, в частности, в экспрессии на их поверхности CD80, CD86, MHCII. Стимулированные флагеллином дендритные клетки усиленно продуцируют TNF- , IL-8, IL-1 , MCP-1, MIP-1 , MIP-1 , RANTES. Показано, что дендритные клетки, стимулированные флагеллингом, в свою очередь, стимулируют пролиферацию Т-клеток и продукцию ими интерферона- . Активация флагеллином моноцитов и макрофагов также усиливает иммунный ответ посредством стимулирования фагоцитоза.
Иммуностимулирующее действие флагеллина проявляется как при его системном введении, так и при воздействии на слизистые оболочки. Взаимодействие с рецептором TLR-5 высокоспецифично и происходит при низких концентрациях флагеллина – до 8,5×10-10 М. Кроме того, поскольку TLR-5 расположен на поверхности клеток, взаимодействие с ним флагеллина не требует предварительного фагоцитоза, чем объясняется быстрота реакции клеток на флагеллин.
Известен ряд патентов, где флагеллин используется в качестве адъюванта при иммунизации против ряда патогенов, в том числе белка, слитого с целевым антигеном в единую полипептидную цепь [WO 2006078657, WO 2011028875], в виде смеси с целевым иммуногеном [EA 201001820] или в виде вирусоподобных частиц, содержащих флагеллин и целевой антиген [US 201205082, WO 2009128949].
Известен патент, где флагеллин может использоваться в качестве иммуностимулятора и иммуномодулятора для лечения заболеваний, связанным с хронической бактериальной инфекцией [WO 2007098371].
Известно также антиапоптотическое действие флагеллина, которое позволило использовать его в качестве радиопротектора и хемопротектора [EA 010291, WO 2009102818].
Недостатком данной технологии является недостаточная эффективность рекомбинантного флагеллина, а также высокая себестоимость флагеллина, связанная с его низким выходом.
Известна технология получения рекомбинантного флагеллина, где предложено его получение из Flic Salmonella entericf Serovar Typhimurium ATCC 14028 [заявка EA 201001820, 2010]. Недостаток данного метода получения флагеллина заключается в необходимости работы с культурой Salmonella, что требует повышенных мер безопасности, увеличивает объем финансовых затрат и времени на получение флагеллина.
Наиболее близким по технической сущности к заявляемому изобретению является разработка авторов [Матюнина Е.А. и др. «Получение рекомбинантного белка FliC в клетках Е. coli»<URL: https://shmain.ru/nauchnye-stati/matyunina-e-a-al-shexadat-r-i-duxovlinov-i-v-poluchenie-rekombinantnogo-belka-flic-v-kletkax-e-coli.html>, где показана возможность получения флагеллина из Е. coli, однако дальнейшие проведенные авторами испытания показали, что он является денатурированным и поэтому неактивным, что вызвало необходимость проведения дополнительных работ, приведших к созданию настоящего изобретения.
Для устранения всех этих недостатков существует необходимость в бактериальных продуцентах, обеспечивающих высокий уровень продукции высокоактивного флагеллина.
Задачей, решаемой авторами, являлось создание технологии, позволяющей получать активный рекомбинантный флагеллин (с удельной активностью не менее 106 Единиц активности/мг), и повышение выхода продукции.
Технический результат был достигнут созданием штамма Escherichia coli BL21[DE3]pET151FliC – продуцента высокоактивного рекомбинантного флагеллина, полученного трансформацией культуры клеток E. coli BL21[DE3] (Invitrogen, США, генотип F- ompT hsdSB (rB-mB-) gal dcm rne131 (DE3) рекомбинантной плазмидной ДНК pET151FliC, созданной in vitro и содержащей ген рекомбинантного флагеллина fliC, вектор pET151FliC, кодирующий биологически активный флагеллин Salmonella typhymurium Т10 по Seq ID No 3.
Полученный штамм E.coli BL21[DE3]pET151FliC депонирован во Всероссийскую коллекцию промышленных микроорганизмов (ВКПМ) ФГУП ГосНИИГенетика под № В-11369 от 30.10.2012.
Штамм E. coli ВКПМ № В-11369 характеризуется следующими культурально-морфологическими и физико-биохимическими свойствами:
Культурально-морфологические особенности штамма: грамотрицательные прямые палочки, размером 1,1-1,5×2,0-3,0 мкм, одиночные, спор и капсул не образуют. Каталазоположительные. Оксидазоотрицательные. Факультативные анаэробы. Клетки хорошо растут на простых питательных средах, содержащих и не содержащих ампициллин, например, на среде LB. На агаризованной среде – колонии гладкие, круглые, слабо выпуклые, с ровным краем. В жидких средах образуют равномерную светорассеивающую суспензию, при хранении без перемешивания оседают на дно. Клетки растут в интервале температур от 8°C до 43°C, интервал для культивирования – 28-38°C, оптимум роста при 37°C. Интервал pH 5-7. Катализируют D-глюкозу и некоторые другие углеводы с образованием кислоты и газа, не сбраживают галактозу. Реакция Фогес-Проскауэра отрицательная, не образуют H2S, гидролизуют мочевину.
Характеристики полезного вещества, синтезируемого штаммом: Рекомбинантный белок – флагеллин, длиной 528 аминокислотных остатков, состоящий из флагеллина FliC Salmonella typhimurium T10 (495 амк) и служебной последовательности длиной 33 аминокислоты
Активность штамма
Продуктивность штамма – рекомбинантный флагеллин составляет не менее 37% белка клеточного лизата при культивировании в условиях индукции.
Криоконсервация. В запаянных ампулах, штамм, лиофильно-высушенный в среде, содержащей на 30 мл воды – 5 г сахарозы, 1,5 г желатина, хранится при комнатной температуре в течении 20 лет.
Культивирование штамма: культивирование при температуре 28-38°С в термостате или качалке, в агаризованной (2% агара) или жидкой LB-среде соответственно. Селективные условия – добавление 100 мкг/мл ампициллина.
Ферментация: ферментацию ведут в жидкой среде PYP-5052, содержащей 0,2% лактозы, с добавлением 100 мкг/мл ампициллина, при перемешивании и аэрировании, при температуре 28-38°С в течение 18 часов.
На фиг.1 приведены электрофореграммы лизатов клеток Escherichia coli ВКПМ № В-11369 при культивировании в условиях индукции синтеза белка лактозой и без индукции, где 1-белковый маркер молекулярного веса, кДа; 2-лизат клеток штамма Е.coli ВКПМ № В-11369 индукции экспрессии 0,2% лактозой; 3-лизат клеток штамма Е.coli ВКПМ № В-11369 без индукции экспрессии 0,2% лактозой.
Сущность изобретения поясняется следующими конкретными примерами использования штамма Е.coli ВКПМ № В-11369.
Пример 1. Создание генетической конструкции, обеспечивающей синтез рекомбинантного флагеллина в клетках Е.coli.
Методом полимеразной цепной реакции с использованием специфических праймеров FliC-For (SEQ ID NO 1) и FliC-Rev (SEQ ID NO 2) на матрице геномной ДНК вакцинного штамма Salmonella typhimurium T10 (RU2192886) был амплифицирован ген fliC, кодирующий флагеллин, который далее был сшит с вектором рЕТ151. Последовательность нуклеотидов полученного гена совпадает с последовательностью флагеллина FliC (флагеллина фазы 1) Salmonella enterica serovar Typhimurium, имеющейся в GeneBank (BAA02846.1) Полученный ген был вставлен в экспрессионный вектор рЕТ151 с получением экспрессионной плазмиды pET151FliC.
Плазмида рЕТ151 FliC обеспечивает синтез в клетках Escherichia coli полноразмерного бактериального флагеллина, дополнительно содержащего с N-конца служебную последовательность длиной 33 аминокислоты, которая обеспечивает высокоэффективную инициацию синтеза белка рибосомами Е.coli, содержит участок, состоящий из 6-ти остатков гистидина (гистидиновый таг), предназначенную для последующей очистки рекомбинантного флагеллина с помощью металлохелатной хроматографии, сайт узнавания антителом V5, а также сайт гидролиза протеиназой TEV, позволяющий при необходимости удалить большую часть служебной последовательности обработкой очищенного рекомбинантного флагеллина вышеназванной протеиназой с последующим повторным циклом металлохелатной хроматографии. Последовательность нуклеотидов искусственного гена, кодирующего рекомбинантный флагеллин, представлена в SEQ ID No 3.
Пример 2. Получение штамма-продуцента рекомбинантного флагеллина и исследование его продуктивности.
Полученной плазмидой pET151FliC были трансформированы клетки Escherichia coli штамма BL21[DE3]Star, содержащие в своем геноме ген, кодирующий полимеразу фага Т7 под контролем бактериального промотора, индуцируемого лактозой. Кроме того, они не содержат протеазу Ion и несут мутацию в гене, кодирующем протеазу OmpT. Отсутствие этих двух протеаз уменьшает деградацию гетерологичных белков. Данный штамм содержит также мутацию в гене rne, кодирующий рибонуклеазу Е, что приводит к увеличению стабильности мРНК в клетке и, как следствие, к повышению продукции клетками данного штамма рекомбинантного белка.
В результате был получен штамм E.coli ВКПМ № В-11369 – продуцент бактериального белка FliC.
Для поддержания полученного штамма-продуцента белка FliC использовали плотную агаризованную LB-среду, содержащую 100 мкг/мл ампициллина и 1% глюкозы.
Продуктивность полученного штамма-продуцента изучали путем культивирования клеток в среде PYP-5052 с 0,2% лактозой, в термостатированной качалке роторного типа при температуре 37°С, скорости вращения платформы 250 об/мин в течение 18 часов. Оптическая плотность (ОП600) культуры после окончания культивирования составила 7 О.Е. В качестве контроля использовали неиндуцированную культуру (без добавления лактозы). Образцы биомассы клеток лизировали и анализировали методом диск-электрофореза в ПААГе в денатурирующих условиях с последующей денситометрией.
Результат представлен на фиг.1.
Как видно из фиг.1, индукция лактозой культуры клеток E.coli ВКПМ № В-11369 приводит к синтезу белка с молекулярным весом примерно 57 килодальтон, что соответствует ожидаемому молекулярному весу для рекомбинантного флагеллина. Анализ денситограммы полиакриламидного геля, представленного на фиг.1, выполненный с помощью программы TotalLab, показал, что рекомбинантный флагеллин составляет 37% общего белка клеточного лизата.
Пример 3. Очистка рекомбинантного флагеллина и изучение его биологической активности.
Рекомбинантный флагеллин очищали из клеточных лизатов методом металлохелатной хроматографии с последующим диализом. Чистота выделенного флагеллина составила не менее 97% по результатам электрофореза в полиакриламидном геле с последующей денситометрией.
Биологическая активность рекомбинантного флагеллина оценивалась в тесте, основанном на способности клеток линии А-549 секретировать интерлейкин-8 при добавлении в культуральную среду флагеллина. Для постановки теста клетки линии А-549 вносили в количестве 5×104 на лунку в 96-луночную плоскодонную культуральную плату («Costar») в 100 мкл среды DMEM/F12 с 10% фетальной сыворотки. Плату инкубировали 24 часа в инкубаторе при 37°С в атмосфере 5% CO2 в условиях абсолютной влажности. За время инкубации клетки в плате образовывали плотный монослой. Далее к клеткам добавляли исследуемые препараты флагеллина в различных концентрациях в объеме 100 мкл в культуральной среде (не менее 3 параллельных лунок для каждой концентрации). Затем плату инкубировали еще 24 часа в СО2-инкубаторе и собирали супернатанты, в которых определяли концентрацию ИЛ-8 с помощью коммерческого набора на основе твердофазного иммуноферментного анализа (ООО «Цитокин»).
Результаты двух экспериментов по определению биологической активности рекомбинантного флагеллина представлены в таблицах 1 и 2.
| Таблица 1 | |
| Определение активности рекомбинантного флагеллина в эксперименте 1 | |
| Концентрация рекомбинантного флагеллина, нг/мл | Концентрация ИЛ-8 в супернатантах, пг/мл (среднее ± станд. отклонение) |
| 100 | 3799±590 |
| 20 | 5368±715 |
| 4 | 5119±370 |
| 0,8 | 1567±266 |
| 0,16 | 442±115 |
| 0,032 | 161±69 |
| 0,0064 | 77±2 |
| Контроль | 98±31 |
| Таблица 2 | |
| Определение активности рекомбинантного флагеллина в эксперименте 2 | |
| Концентрация рекомбинантного флагеллина, нг/мл | Концентрация ИЛ-8 в супернатантах, пг/мл (среднее ± станд. отклонение) |
| 10 | 5658±957 |
| 2 | 4470±950 |
| 0,4 | 795±34 |
| 0,08 | 202±30 |
| 0,016 | 114±19 |
| 0,0032 | 74±38 |
| 0,00064 | 94±7 |
| Контроль | 104±13 |
Из таблиц 1 и 2 следует, что рекомбинантный флагеллин, продуцируемый клетками штамма E.coli ВКПМ № В-11369, обладает биологической активностью и дозозависимо усиливает продукцию ИЛ-8 клетками А549, 50% эффективная доза для рекомбинантного флагеллина составляет примерно 10 нг/мл.
Преимуществом штамма E.coli ВКПМ № В-11369 является высокая биологическая активность в качестве адъюванта.
Источник