Питательная среда для бактерий кишечной палочки

Бактерии – живые организмы. Выращивать их хоть и трудно, но интересно. Микробиология до сих пор еще не научилась культивировать большую часть известных видов бактерий. Именно получение нужных питательных сред и создание оптимальных условий, обеспечивающих рост микроорганизмов в искусственных условиях, – одна из основных задач этой науки. Бытовой же интерес к культивированию микробов формируется из двух основных составляющих: желания научиться самостоятельно идентифицировать микроорганизмы и попытки использовать их для решения собственных утилитарных задач. Для успешной постановки эксперимента исследователю необходимо выделить чистую культуру и подобрать оптимальную питательную среду для бактерий.

Выделение чистой культуры

В природе бактерии чистыми культурами не живут. В ста случаях из ста они обитают микробными сообществами, которым присуще функциональное разделение ролей. Одни микроорганизмы дают пищу другим, третьи создают условия для существования четвертых и так далее. Такой принцип общежития, увеличивающий жизнеспособность бактерий в окружающей среде, создает определенную трудность для исследователя: необходимость выделения чистой культуры из бактериального сообщества для ее предметного изучения.

Сегодня микробиология использует следующие способы выделения чистых культур:

Метод Дригальского используется для выделения аэробов (кислорододышащих микроорганизмов). Проводится в несколько этапов, на каждом из которых исследуемое бактериальное сообщество разделяется на более мелкие сообщества. Изучается их рост и характер развития до выделения чистой культуры.
Метод Коха, при котором для выделения чистых культур используется бактериологическая петля и полурасплавленный агар-агар. Внутрь вязкого агар-агара бактериологической петлей поселяют колонию, при этом хорошенько размешивают ее по всей поверхности. После того, как агар-агар застывает, делают еще три-четыре разведения, материал для которого берется в каждой новой партии. К последнему разведению в агар-агаре содержится уже минимальное количество бактерий, пригодных для выделения. Изолированную колонию переселяют на свежую питательную среду.
Метод Вейнберга. Применяется для выделения анаэробных микроорганизмов. Используется с применением анаэростата. Бактерий разводят по методу Коха 6-7 раз, после каждого разведения отправляют в анаэростат. Последнюю пробирку со средой и с бактериальной колонией быстро охлаждают и заливают парафином с вазелиновым маслом, которые перекрывают доступ кислорода в пробирку. В результате колония анаэробных микроорганизмов растет под наблюдением исследователя, который всегда может изучить поселение в пробирке и определить рост колонии, а также характер ее развития.

Внешне чистая культура представляет собой однородный обособленный нарост на питательной среде для бактерий. Такие иногда можно увидеть на испорченных продуктах питания. Считается, что именно в одном таком обособленном наросте обитают бактерии, произошедшие из одной бактериальной клетки.

Микробиология за свою историю изобрела много способов для выделения чистых бактериальных культуры. Многие из них невозможно использовать в домашних условиях. И это при том, что даже для использования простых способов выделения чистых культур исследователю придется приобретать определенное количество лабораторных приспособлений. Но если простые чашки Петри, трубки Бурри и тот же анаэростат приобрести вполне по силам, то многие другие лабораторные установки требуют капитальных финансовых вложений.

Культивирование колоний микроорганизмов: принципы

После выделения чистой колонии исследователь должен определить наилучшие условия для ее культивирования.

Следует учесть, что в окружающем мире рост и развитие бактерий сильно ограничены внешними условиями. В процентном соотношении бактерии используют только 1% от своих возможностей. Пересаживая же бактериальную культуру на питательную среду для выращивания, человек должен искусственно создать оптимальные условия для развития именно этой бактерии, что даст ей возможность задействовать весь свой потенциал. В противном случае рост культуры не будет заметен и как такового выращивания не произойдет.

Одной из основных задач микробиологов является определение максимальной питательной смеси для каждого вида бактерий (особенно это важно для тех микроорганизмов, которых задействуют для промышленных производств), чтобы получить их максимальную производительность.

В микробиологии есть ряд требований к питательным средам, на которых допускается возможность культивирования чистых бактериальных колоний:

среда должна содержать факторы, обеспечивающие рост данной культуры (витамины, аминокислоты);
допустимый для данной среды фактор рН;
давление среды не должно быть выше или ниже давления внутри клетки (изотоничность);
стерильность;
прозрачность среды, чтобы у исследователя была возможность наблюдать рост и развитие культур.

Принципы культивирования молочнокислых бактерий

К проблеме выращивания молочнокислых бактерий человек имеет определенное отношение с тех давних времен, когда начал употреблять в пищу кисломолочные продукты. Но эти неконтролируемые способы получения в домашних условиях продуктов кисломолочного брожения имеют весьма опосредованное отношение к научно обоснованным способам культивирования представителей рода Лактобацилл.

Цель выращивания штаммов (чистых культур) бактерий рода Лактобацилл – не только промышленное производство молочных продуктов, но и получение наиболее эффективны штаммов пробиотиков и выявление среди бактериальных сообществ молочнокислых бактерий с условно-патогенной и патогенной природой.

Один из самых распространенных способов выращивания молочнокислых представителей рода Лактобациллы – использование в качестве питательной среды для культивирования гидролизатов молочных белков (частично разрушенных пептидов). Именно в таком частично расщепленном виде представители рода Лактобациллы наилучшим образом усваивают необходимые им питательные вещества.

В быту гидролизаты чаще всего можно найти в питательных молочных смесях для вскармливания грудных детей либо в обезжиренном сухом молоке. Чтобы рост колоний молочнокислых бактерий происходил активнее, в питательную среду добавляются протеолитические ферменты (ферменты, способствующие расщеплению связей между аминокислотами в белках).

Благодаря добавлению таких ферментов, для колонии молочнокислых бактерий, которая выращивается, отпадает необходимость самостоятельно продуцировать ферменты, расщепляющие молочные белки. Вся энергия бактерий тратится на рост, размножение и увеличение биомассы, что зачастую является основной целью культивирования молочнокислых бактерий.

Цена одного килограмма питательной среды – около 50 долларов США. Однако само оборудование для выращивания этих микроорганизмов очень недешево.

Культивирование анаэробных представителей рода Энтерококков

Для анаэробных представителей рода Энтерококков необходимо соблюдение специфических требований по выделению и выращиванию этих микробов в лабораторных условиях. Специфика связана с тем, что необходимо контролировать режим доступа света и тепла, которые обеспечивают рост колонии. Хоть микроорганизмы, относящиеся к виду кишечной палочки (Эшерихия Коли), и являются факультативными анаэробами, то есть могут жить в присутствии кислорода, метаболизм этих организмов происходит только в анаэробных условиях, в отсутствие кислорода.

Выращивание этих анаэробных микроорганизмов опасно в домашних условиях.

Питательная среда для выращивания представителей рода Энтеробактерии – кишечной палочки – агар-агар с добавлением:

сорбита,
сульфита натрия,
хлорида натрия.

Такая среда была сконструирована для представителей рода Энтеробактерии – кишечной палочки, после установления ее способности ферментировать (перерабатывать) сорбитол.

Посев с представителями рода Энтеробактерии обязательно нужно держать в темных местах, без доступа света, в термостате при температуре 30°С. К увеличению роста колонии этих анаэробных организмов приводит добавление в питательную среду глюкозы.

Выращивание представителей рода Энтеробактерии – кишечной палочки осуществляется с целью выработки анатоксина кишечной палочки (вещества, препятствующего токсикации организма вследствие отравления продуктами жизнедеятельности кишечной палочки).

Оптимальные питательные среды для микробиологических исследовательских лабораторий находятся в свободной продаже. Цена питательной смеси для выделения и культивирования анаэробных бактерий не слишком высока. Но одной питательной среды мало. Ни одна лаборатория не обойдется без целого ряда специального оборудования, цена на которое очень высокая, и достать его довольно сложно.

Работаю врачом ветеринарной медицины. Увлекаюсь бальными танцами, спортом и йогой. В приоритет ставлю личностное развитие и освоение духовных практик. Любимые темы: ветеринария, биология, строительство, ремонт, путешествия. Табу: юриспруденция, политика, IT-технологии и компьютерные игры.

Источник

Среда Хейфеца.Выпускается в сухом виде. В состав, кроме основных питательных компонентов (вода, пептон, маннит, натрия хлорид), входят розоловая кислота, раствор метиленового синего. Готовая среда красно_фиолетового цвета, при росте кишечной палочки рН сдвигается в кислую сторону, и среда приобретает зеленоватую окраску.

ХБ.В 1000 мл воды растворяют 10 г пептона, 5 г маннита, 5 г хлорида натрия. Приготовленную смесь кипятят 15–20 мин, устанавливают рН 7,4–7,6, процеживают через бумажный фильтр, кипятят фильтрат 10 мин, охлаждают до температуры +60_С, после чего прибавляют 30 мл дрожжевого диализата, 15 мл желчи, 10 мл раствора хинозола и 10 мл 1,6%_ного спиртового раствора бромкрезола пурпурного. Среду разливают в стерильные пробирки по 7–8 мл.

Среда Кесслера.К 1000 мл дистиллированной воды добавляют 10 г пептона и 50 мл бычьей желчи. Смесь кипятят на водяной бане при помешивании в течение 20–30 мин, фильтруют через вату, добавляют 2,5 г лактозы, доводят объем дистиллированной воды до 1000 мл, устанавливают рН 7,4–7,6, добавляют 2 мл 1%_ного водного раствора генцианвиолета, разливают в пробирки с поплавками по 8–10 мл и стерилизуют при температуре +121_С в течение 10 мин. Готовая среда имеет темно-фиолетовый цвет.

Индикация сальмонелл.Навесок колбасы массой 25 г от объединенной пробы, тщательно измельченный ножницами, вносят во флакон, содержащий 100 мл среды обогащения (Мюллера, Кауфмана, хлористо-магниевой) или 225 мл селенитового бульона. Флакон встряхивают и помещают в термостат при температуре +37_С, через 24 ч петлей или пастеровской пипеткой проводят высев из среды обогащения в чашки Петри со средой Эндо, Плоскирева, Левина или ВСА. Посевы помещают в термостат при температуре +37_С на 16–24 ч. На среде Эндо, Плоскирева и Левина бактерии из рода сальмонелл образуют бесцветные колонии. На ВСА сальмонеллы образуют черные или коричневые колонии с металлическим блеском, при этом участок среды под агаром чернеет. Не менее 5 изолированных колоний, характерных для сальмонелл, пересевают на трехсахарный агар Крумвиде–Олькеницкого в модификации Ковальчука штрихом по скошенной поверхности и уколом в столбик и инкубируют при температуре +37_С в течение 12–16 ч.

При росте сальмонелл на трехсахарном агаре цвет скошенной поверхности среды розовый, столбик — желто-бурый. Газообразование устанавливают по наличию трещин и разрыву столбика агара, при образовании сероводорода питательная среда чернеет.

Другие грамотрицательные бактерии семейства энтеробактерий дают следующие изменения цвета трехсахарного агара:

-БГКП окрашивает среду в синий или сине-зеленый цвет с образованием газа или без него;

-палочка протея окрашивает среды в ярко-красный цвет (вследствие расщепления мочевины), в случае выделения Н2S может появиться черный осадок с возможным разрывом агара.

Для дальнейшей идентификации бактерий готовят мазки, которые окрашивают по Граму, микроскопируют, а также изучают антигенные свойства путем постановки РА на предметном стекле с поливалентной (или комплексной) сальмонеллезной агглютинирующей сывороткой. Далее проводят идентификацию с помощью монорецепторных О- и Н-агглютинирующих сальмонеллезных сывороток.

Обнаружение подвижных (кроме S. gallinarum и S. pullorum) грамотрицательных палочек, дающих характерный рост на элективных средах, не ферментирующих лактозу и сахарозу, сбраживающих глюкозу и маннит до кислоты и газа (S. typhisuis маннит не ферментирует), образующих Н2S и не образующих индол, дающих положительную реакцию агглютинации с комплексными, монорецепторными О- и Н-агглютинирующими сальмонеллезными сыворотками, указывает на выделение бактерий из рода сальмонелл.

Индикация протеяв Н_форме проводится внесением исследуемого продукта в конденсат свежескошенного МПА (метод Щукевича). Посевы помещают в термостат на 18–24 ч при температуре +37_С. При наличии в исследуемом продукте протея подвижная палочка поднимается вверх по скошенной поверхности агара, образуя вуалеобразный голубоватый налет. Культура издает характерный гнилостный запах.

Обнаружение полиморфных грамотрицательных палочек, подвижных, сбраживающих глюкозу и мочевину, не ферментирующих лактозу и маннит, указывает на наличие в продукте бактерий из рода протея.

Индикация стафилококкав исследуемом продукте основана на изучении морфологии, культуральных свойств и способности некоторых стафилококков ферментировать лецитиназу и коагулировать цитратную плазму крови кролика под воздействием фермента коагулазы.

Вначале исследуемый продукт разводят 1 : 10, вносят в МПБ, содержащий 6,5% натрия хлорида. Через сутки после инкубирования в термостате проводят пересев на молочно-солевой агар для изучения наличия пигмента и на желточно-солевой агар для выявления лецитиназной активности.

Посевы выдерживают 24 ч в термостате и сутки при комнатной температуре, затем учитывают результат: на поверхности питательной среды стафилококки образуют слегка выпуклые круглые колонии с ровными краями, т. е. S-формы; на желточно-солевом агаре вокруг колоний стафилококков появляется «радужный венчик», что является одним из признаков их патогенности (лецитовителазная активность).

Не менее чем из 5 типичных колоний готовят препараты, которые окрашивают по Граму и микроскопируют. При наличии стафилококков обнаруживают грамположительные кокки, располагающиеся в виде беспорядочных кучек и гроздьев винограда. Для подтверждения патогенности выделенных стафилококков ставят реакцию плазмокоагуляции по следующей методике: в пробирку с 0,5 мл цитратной плазмы крови кролика, разведенной физраствором (1 : 5), вносят петлю чистой суточной культуры стафилококка и помещают в термостат при температуре +37_С. Реакцию плазмокоагуляции предварительно учитывают через 3–4 ч (осторожно наклоняя, не встряхивая пробирку). В сомнительных случаях пробирки оставляют в термостате для окончательного учета через 24 ч. Реакцию считают положительной, если плазма коагулирует в сгусток (реакцию подвижная палочка поднимается вверх по скошенной поверхности агара, образуя вуалеобразный голубоватый налет. Культура издает характерный гнилостный запах.

Для подтверждения патогенности выделенных стафилококков ставят реакцию плазмокоагуляции по следующей методике: в пробирку с 0,5 мл цитратной плазмы крови кролика, разведенной физраствором (1 : 5), вносят петлю чистой суточной культуры стафилококка и помещают в термостат при температуре +37_С. Реакцию плазмокоагуляции предварительно учитывают через 3–4 ч (осторожно наклоняя, не встряхивая пробирку). В сомнительных случаях пробирки оставляют в термостате для окончательного учета через 24 ч. Реакцию считают положительной, если плазма коагулирует в сгусток (реакцию оценивают по степени плотности сгустка от одного до четырех плюсов).

Индикация сульфитредуцирующих клостридий (СРК)в колбасе основана на учете специфического роста клостридий в железосульфитсодержащих средах. При взаимодействии натрия сульфита с хлоридом железа образуется сульфат железа, который вызывает почернение питательной среды.

Для выявления СРК 1 мл исследуемой взвеси стерильной пипеткой вносят в пробирку с 9 мл жидкой сульфит-циклосериновой среды или среды Вильсон–Блера. Затем проводят последовательные пересевы на аналогичные объемы среды и получают возрастающие 10_кратные разведения суспензии. Посевы выдерживают 18–20 ч при температуре +37_С, при наличии СРК среда чернеет.

Для подтверждения принадлежности выделенных культур к клостридиям проводят пересев на поверхность агаризованной плотной среды Вильсон–Блера и инкубируют в анаэробных условиях при температуре +37_С в течение 24–48 ч. Отбирают типичные колонии и изучают микроорганизмы по морфологическим и некоторым культурально-ферментативным свойствам, в частности, по отрицательной реакции на каталазу.

Если в посевах (в 4 колониях из 5) обнаружены СРК, спорообразующие палочки, грамположительные, каталаза-отрицательные, способные расти в анаэробных условиях, то делают заключение о наличии в продукте СРК по максимальному разведению суспензии, в посеве которого наблюдается почернение среды. Например, если характерные изменения наблюдаются в пробирках с разведением 10–1, то считают, что в 1 г исследуемого продукта содержится 10 клеток, при аналогичных изменениях в пробирках с разведением 10–2 — 100 клеток.

При получении неудовлетворительных результатов микробиологического анализа готовой продукции по требованию контролирующих организаций проводят исследование вспомогательных материалов при постоянном входном контроле.

Источник