Рекомбинантные продуценты интерлейкинов кишечная палочка

Лекция № 7

   Тема: Интерлейкины. Получение рекомбинантного человеческого интерлейкина.

   План:   1. Общая характеристика цитокинов.

             2. Характеристика групп интерлейкинов, 1,2.

             3. Технология рекомбинантного интерлейкина.

Ключевые слова:  цитокины, интерлейкины, интерфероны

   Цитокины – низкомолекулярные гормоноподобные медиаторы, продуцируемые разными клетками организма и способные влиять на функции других или этих же групп клеток. Цитокины – пептиды или гликопротеиды, действующие как аутокринные, паракринные или межсистемные сигналы. Цитокины формируются как активированными или поврежденными, так и клетками без дополнительной стимуляции. Регуляторами продукции цитокинов могут быть другие цитокины, гормоны, простагландины, антигены и многие другие агенты, воздействующие на клетку. Цитокины составляют обширный класс медиаторов различного происхождения, обладающих разными свойствами. Их классификация носит условный характер, так как многие из них обладают одновременно несколькими свойствами и могут быть отнесены к разным группам. Цитокины объединены в группы в зависимости от их происхождения (лимфокины, монокины), от характера эффекта (провоспалительные, противовоспалительные). Цитокины, регулирующие взаимодействия лейкоцитов между собой и другими клетками, называют интерлейкинами – ИЛ.       Различают несколько групп цитокинов:

–    группа интерлейкинов;

– группа факторов роста (эпидермальный, фактор роста нервов), колониестимулирующие факторы, хемотаксические факторы;

–  цитотоксины или цитокины группы фактора некроза опухолей;

–  интерфероны.

    Группа интерлейкинов включает более 20 цитокинов, большинство из которых играет ключевую роль в развитии специфического иммунного ответа.

    Продукция ИЛ-1 осуществляется преимущественно моноцитами и макрофагами.  Синтез ИЛ-1 начинается в ответ на внедрение микроорганизмов или повреждение тканей и запускает комплекс защитных реакций, составляющих первую линию обороны организма. Одно из главных свойств ИЛ-1, заключается в способности стимулировать функции и увеличивать число лейкоцитов.  ИЛ-1 обусловливает  пролиферацию лимфоцитов при индукции иммунного ответа, а также активирует  Т-лимфоциты, увеличивает продукцию антител.  Этот цитокин – эндогенный пироген, вызывающий лихорадку за счет воздействия на гипоталамический центр терморегуляции.

   Интерлейкин – 2 – ИЛ-2 обладает относительно узким спектром мишеней и объектов: Т- и В-лимфоциты, NK-клетки. Является для них фактором роста и дифференцировки. ИЛ-2 способствует реализации функции Т-хелперов, усиливая выработку гамма – интерферона, препятствует развитию иммунологической толерантности, способен ее отменять. ИЛ-2 служит ростовым и дифференцировочным фактором для Т-киллеров. На В-лимфоциты ИЛ-2 действует как один из ростовых факторов, может повышать синтез IgM, IgG, IgA. ИЛ-2 при воздействии на NK-клетки увеличивает их цитотоксическую активность и расширяет спектр их цитотоксического действия. ИЛ-2 воздействует также на моноциты, усиливая генерацию активных форм кислорода и перекисей, а также на процесс кроветворения. Он повышает образование эозинофилов и тромбоцитов, но подавляет миелоидный и эритроидный ростки кроветворения, способствует развитию экстрамедуллярных очагов гемопоэза.

   Производство человеческого интерлейкина основано на технологии рекомбинантной ДНК. Ген человеческого интерлейкина встраивается в плазмидный вектор и трансформируется  в бактериальные  клетки E.coli  либо в дрожжевые клетки Saccharomycescerevisiae. Плазмидная конструкция, трансформированная в дрожжевые клетки содержит ген человеческого ИЛ-2 и фрагмент ДНК маркерного пептида, кодирующие синтез химерного белка. Химерный белок стабилизирует и защищает человеческий белок от внутриклеточного расщепления.  Технология ферментации данных продуцентов (Saccharomycescerevisiae) и технология очистки с применением оригинальных сорбентов и выделение ИЛ2 методом аффинной хроматографии   отработаны и осуществляются на предприятиях, укомплектованных соответствующим оборудованием. 

В России освоен выпуск двух рекомбинантных интерлейкинов: Беталейкина (E.coli) и Ронколейкина (Saccharomycescerevisiae).  Способ получения рекомбинантного интерлейкина-2 человека (Ронколейкина), секретируемого дрожжами Saccharomyces cerevisiae из культуральной среды штамма GRF 18-pJDB(ALPHOIL) (ВКПМ У -1038), состоит из следующих основных этапов: выращивания клеток штамма GRF 18-pJDB(ALPHOIL) на минеральной среде с пониженным содержанием неорганического фосфата; концентрирования интерлейкина-2 с помощью СМ-сефадекса или СМ-целлюлозы; очистки интерлейкина-2 хроматографией на смоле с обращенной фазой, лиофильного высушивания интерлейкина-2 в присутствии маннитола. Рекомбинантный интерлейкин-2 человека имеет удельную биологическую активность 10-30 млн.ед/мг. Электрофоретическая чистота свыше 90% и удельная биологическая активность в тесте на индукцию пролиферации клеток линии CTLL-2 10-30 млн. международных ед/мг белка.

   В медицинской практике интерлейкин 1, 2 применяются при лечении врожденных и приобретенных иммунодефицитных состояний, хронических вирусных гепатитов, гнойно-септических хирургических инфекциях.  Однако, лечение сопряжено с высокой токсичностью препаратов, что  ограничивает его широкое  применение наряду с крайне высокой стоимостью.

   Контрольные вопросы:

1.      Характеристика цитокинов, групп.

2.      Характеристика интерлейкинов (20), их функций.

3.      Технологии рекомбинантных интерлейкинов.

4.      Получение рекомбинантного интерлейкина с помощью E.coli.

5.      Получение рекомбинантного интерлейкина с помощью Saccharomycescerevisiae

6.      Характеристика способов очистки в технологиях получения рекомбинантных интерлейкинов – СРС.

7.      Характеристика рекомбинантных интерлейкинов: Беталейкина и Ронколейкина-СРС.

8.      Применение рекомбинантных интерлейкинов в медицинской практике – СРС.

9.      Побочные эффекты рекомбинантных интерлейкинов – СРС.

10.  Характеристика и получение рекомбинантных факторов роста – СРС.

   Использованная литература:

1.      Медицинская  биотехнология.  К.Х.Алмагамбетов.  // Астана. – 2009. – 232 с.

2.      Молекулярная биотехнология. Б.Глик, Дж.Пастернак. // Москва «Мир». – 2002. – 589с.

3.      Основы биотехнологии. Т.А.Егорова, С.М.Клунова, Е.А.Живухина. // Москва. – «Академия». – 2008. – 208с.

4.      Биотехнология. Н.В.Загоскина, Л.В.Назаренко и др. //  Москва. – «Оникс». – 2009. – 496с.

   5. Биотехнология иммунобиологических препаратов. Краснопольский Ю.М.,   Борщевская М.И. // Харьков. – 2006. – 241с.