Титр кишечной палочки в воде
Вирусы и бактерии
Патогенные микроорганизмы относятся к паразитам, развивающимся на органическом субстрате. Микробы, попадающие в воду, могут вызвать такие заболевания как брюшной тиф, паратиф, амебиаз, острый гастроэнтерит, дизентерия, бруцеллез, инфекционный гепатит, холера, сибирская язва, полиомиелит, туляремия, туберкулез и многие другие.
Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) приводит данные о том, что до 80% всех заболеваний в мире связано с употреблением в пищу воды неудовлетворительного качества. Дополнительную роль играет и нарушения санитарно-гигиенических требований при организации водоснабжения.
Проблема недостатка качественной питьевой воды по-прежнему не теряет своей актуальности.
Показатели микробиологии воды
Основной микробиологический показатель — число микробов — количество бактерий и др. микроорганизмов, содержащихся в 1 мл воды.
По санитарно-гигиеническим нормам, количество бактерий в 1 мл питьевой воды не должно превышать 100.
О безопасности питьевой воды также судят по количеству в ней бактерий группы кишечной палочки (E. Coli). Если в воде присутствует кишечная палочка — значит, она была загрязнена фекальными стоками, и в нее могли попасть возбудители многих инфекционных заболеваний.
Определение всего многообразия бактерий в воде слишком трудоемко, поэтому эпидемические показатели воды по микробиологии включают в себя определение коли-титра и коли-индекса по бактериям кишечной палочки.
Коли-титр — это минимальный объем воды в мл, в котором обнаруживается одна бактерия кишечная палочка.
Коли-титр определяют методом брожения, который заключается в исследовании воды на содержание в ней бактерий при температуре 37°C. Ориентировочно за коли-титр принимают тот наименьший объем воды, при исследовании которого были найдены кишечные палочки. Вероятные значение коли-титра для воды, сыворотки, молока, кваса, других различных стоков определяют при помощи таблицы, сравнивая полученные результаты. Учет выросших бактерий на плотных средах и мембранных фильтрах считается более точным, чем метод брожения, описанный выше.
Обратная величина — коли-индекс — показывает количество обнаруженных кишечных палочек в 1 л воды.
Коли-индекс определяют с применением метода мембранных фильтров или непосредственного посева разного объема исследуемой жидкости на плотные питательные среды. Мембранные фильтры задерживают на поверхности мембран различные бактерии. После этого фильтры помещают в емкости со средой при температуре 37°C и исследуют рост колоний бактерий различных цветов. Для определения коли-индекса подсчитывают выросшие на фильтре колонии кишечной палочки и затем проводят перерасчет на 1 л жидкости.
Санитарные нормы:
— значение параметра коли-титр для питьевой воды должно быть не менее 300,
— коли-индекс — до 3,
— микробное число не должно быть больше 100.
Чтобы получить более точные данные о наличии различных микроорганизмов в воде и степени их загрязнений, необходимо наряду с определением коли-индекса (коли-титра) для кишечных палочек проводить исследование воды и на другие микробиологические организмы, например энтерококки, споровые анаэробы, кишечные бактериофаги.
Источник
КОЛИ-ИНДЕКС, КОЛИ-ТИТР — количественные показатели фекального загрязнения воды, пищевых продуктов, почвы и других объектов окружающей среды, основанные на исследовании содержания в них кишечной палочки.
Кишечная палочка (см.) выбрана в качестве санитарно-показательного микроорганизма, т. к. она в значительном количестве выделяется с фекалиями в окружающую среду, где длительно сохраняется и легко может быть изолирована и идентифицирована. Присутствие кишечной палочки в исследуемых субстратах указывает на возможность наличия в них других, в т. ч. патогенных для человека микроорганизмов кишечной группы, непосредственное обнаружение которых затруднено. Высокое содержание кишечной палочки в тех или иных субстратах может свидетельствовать об интенсивном фекальном загрязнении и повышает эпидемиол. опасность этих субстратов. Поэтому питьевая вода и различные пищевые продукты подвергаются постоянному санитарно-бактериол. контролю, предусматривающему определение коли-титра и коли-индекса.
Коли-индекс — количество кишечных палочек, обнаруживаемое в 1 л жидкости или 1 кг твердого вещества (для пищевых продуктов и почвы — в 1 г). Коли-индекс определяется методом мембранных фильтров или путем непосредственного посева различных количеств исследуемого материала на плотные среды. Сущность метода мембранных фильтров заключается в фильтровании определенных объемов исследуемой жидкости (или твердого вещества, разведенного в воде) через мембранные фильтры № 2 или № 3, на которых задерживаются бактерии. Фильтры переносят на чашки со средой Эндо, инкубируемые при t°37°, а затем исследуют выросшие на поверхности фильтра темно-красные с металлическим блеском, а также розовые и прозрачные колонии. Из колоний каждого типа готовят мазки и окрашивают их по Граму. Колонии разных типов проверяют на оксидазную активность, к-рая должна быть отрицательной. Бесцветные и розовые колонии дополнительно засевают на полужидкую среду с глюкозой и индикатором, на к-рой в течение 24-часовой инкубации при t° 37° должны образоваться кислота и газ. Для определения коли-индекса подсчитывают выросшие на фильтре колонии кишечной палочки и затем проводят перерасчет на 1 л, 1 кг или 1 г в зависимости от исследуемого материала. Таким же образом проводят изучение колоний и их подсчет при прямом высеве материала на среду Эндо.
Коли-титр — наименьшее количество жидкости или твердого вещества (выраженное соответственно в миллилитрах или граммах), в к-ром обнаруживаются кишечные палочки. Коли-титр определяют бродильным методом, заключающимся в посеве определенных объемов исследуемого субстрата в среды накопления, которые выдерживают при t° 37°. В качестве сред накопления используют глюкозопептонную или лактозопептонную среду с индикатором и поплавком и другие подобные среды. Большие объемы засевают в концентрированную среду, малые объемы — в пробирки со средой нормальной концентрации. Из всех помутневших пробирок, вне зависимости от образования кислоты и газа, делают высевы на среду Эндо с последующей идентификацией выросших колоний.
Ориентировочно за коли-титр принимают тот наименьший объем, при посеве к-рого на среды накопления выявлены кишечные палочки. Наиболее вероятное значение коли-титра воды, молока, пива и др. определяют с помощью специальных расчетных таблиц, сопоставляя с ними полученные результаты. В целом бродильный метод менее точен, чем учет выросших бактерий на плотных средах и мембранных фильтрах.
Коли-титр — величина, обратная коли-индексу, который является прямым показателем фекального загрязнения. Возможен пересчет коли-титра в коли-индекс и обратно. Предельно допустимые величины коли-титра (коли-индекса) нормированы общесоюзным стандартом или республиканскими техническими условиями, а также специальными инструкциями органов здравоохранения и других ведомств. Напр., по ГОСТ 2874 — 73 коли-индекс на питьевую воду, поступающую к потребителям через краны водопроводной сети, должен быть не более 3, а коли-титр не менее 300.
Для получения более точных данных о наличии и степени фекального загрязнения объектов считается целесообразным наряду с определением коли-титра (коли-индекса) проводить одновременный количественный учет в исследуемом материале и других санитарно-показательных микроорганизмов (напр., протея, энтерококков, споровых анаэробов, кишечных бактериофагов); в некоторых странах такое комплексное определение введено в практику при санитарно-бактериол. исследовании воды.
См. также Микробное число.
Библиография: Методы санитарно-микробиологического исследования объектов окружающей среды, под ред. Г. И. Сидоренко, М., 19 78; Санитарная микробиология, под ред. Г. П. Калины и Г. Н. Чистовича, М., 1969.
Н. С. Горячкина.
Источник: Большая Медицинская Энциклопедия (БМЭ), под редакцией Петровского Б.В., 3-е издание
Рекомендуемые статьи
Источник
Санитарно-бактериологическое исследование воды – Ф. К. Черкес
Исследованию подлежит вода:
1) централизованного водоснабжения;
2) из колодцев различного типа;
3) открытых водоемов (рек, озер, морей);
4) плавательных бассейнов;
5) сточных вод.
Примечание. Пробы хлорированной воды берут во флаконы с дехлоратором (гипосульфитом).
Отбор проб воды. Из открытых водоемов воду берут с помощью специальных бутылей или батометров, снабженных грузилами. Пробу воды рекомендуют брать на глубине 10-15 см от поверхности (так как поверхность подвергается воздействию атмосферных факторов) и на расстоянии 1,5 м от берега (вода у самого берега может быть загрязнена микрофлорой почвы).
Для отбора проб водопроводной воды используют стерильные флаконы вместимостью 500 мл, закрытые ватно-марлевыми пробками и покрытые бумажными колпачками.
Кран предварительно обжигают тампоном, смоченным спиртом, после чего воду спускают в течение 10-15 мин и набирают во флаконы. Заполненные флаконы закрывают стерильными пробками.
Примечание. Исследуют 333 мл воды (табл. 54).
Таблица 54. Эмпирическая таблица ГОСТ 16963-73
В распределительной сети водопровода отбор проб воды осуществляют в зависимости от количества населения, проживающего в зоне обслуживания.
Стандартные методы исследования регламентированы для воды центрального водоснабжения (ГОСТ 18963-73) и предусматривают:
1. Определение общего числа микроорганизмов (в 1 мл исследуемой воды должно быть не более 100).
2. Определение коли-индекса и коли-титра (коли-индекс 3, коли-титр 333 и выше; для Москвы и Ленинграда коли-индекс не более 2, а коли-титр более 500).
3. Исследование по эпидемиологическим показаниям на патогенную микрофлору (патогенных микроорганизмов не должно быть обнаружено).
Определение общего числа бактерий
Согласно ГОСТу 18963-73 общее число бактерий – это то количество микроорганизмов, которое содержится в 1 мл исследуемой воды, способных в течение суток при температуре 37° С образовывать колонии, видимые невооруженным глазом (или при увеличении с помощью лупы).
Первый день исследования
При исследовании водопроводной воды засевают 2 чашки. В одну из них вносят 1 мл неразведенной воды, в другую 1 мл воды, разведенной в 10 раз (т. е. 0,1 мл исходной пробы).
При исследовании более загрязненной воды засевают 1 мл воды, разведенной в 100 раз. Это соответствует 0,01 и 1 мл .воды, разведенной в 1000 раз (0,001 мл) и т. д. Для получения таких объемов готовят последовательно десятикратные разведения, по 1 мл каждого разведения вносят в чашку и заливают тонким слоем (12-15 мл) растопленного и остуженного до 45° С питательного агара. Для равномерного распределения исследуемой воды залитые агаром чашки перемешивают путем вращения их. После застывания агара посевы ставят в термостат и инкубируют при температуре 37° С 24 ч.
Второй день исследования
Чашки с посевами вынимают из термостата и подсчитывают число выросших колоний. Учитывают только те чашки, где число колоний находится в пределах 30-300. Если колоний немного, их подсчитывают невооруженным глазом или при помощи лупы.
Если колоний много, то подсчет можно вести с помощью специального прибора для счета микробных колоний (рис. 54).
Рис. 54. Прибор для счета колоний микроорганизмов. 1 – столик для чашки Петри; 2 – игла с пружинным устройством; 3 – показатель счетчика; 4 – тумблер для включения импульсного счетчика; 5 – тумблер для включения лампы освещения счетчика
Подсчитанное количество колоний умножают на разведение и узнают число микробов в 1 мл исследуемой воды.
Определение БГКП
Наличие БГКП (бактерий группы кишечной палочки) является показателем фекального загрязнения, интенсивность которого характеризуют:
Коли-индекс – количество кишечных палочек, обнаруженных в 1 л воды.
Коли-титр – наименьшее количество воды, в котором обнаруживают присутствие кишечной палочки*.
* ()
Для выявления в воде БГКП можно пользоваться двумя методами: титрационным (бродильным) и методом мембранных фильтров.
Титрационный метод
Для исследования воды используют среду накопления глюкозопептонную (ГПС) среду Эйкмана с индикатором и бродильными трубками. Среда готовится концентрированной (в 10 раз) и нормальной концентрации – для посева 1 мл воды.
Первый день исследования
Исследуемую воду засевают по 100 мл в 3 колбы, по 10 мл в 3 пробирки (с концентрированной средой) и по 1 мл в 3 пробирки (со средой нормальной концентрации) – всего 333 мл. Посевы инкубируют в термостате при 37° С 24 ч.
Второй день исследования
Вынимают посевы из термостата и просматривают их.
При наличии помутнения в колбах или пробирках из них производят посев петлей на сектора среды Эндо в чашках Петри. Посевы инкубируют в термостате при 37° С.
Третий день исследования
Вынимают чашки из термостата. Из подозрительных колоний делают мазки. При наличии грамотрицательных палочек ставят пробу на оксидазную активность. Положительная проба на оксидазу дает право дать отрицательный ответ.
Проба на оксидазу. 1-й способ: со среды Эндо снимают петлей 2-3 колонии каждого типа и наносят на поверхность фильтровальной бумаги, смоченной диметилпарафенилендиамином. Положительная реакция характеризуется посинением штрихов, сделанных из колоний.
2-й способ: реактив можно нанести на изолированную колонию на среде Эндо (красная колония – синеет) (рис. 55).
Рис. 55. Определение коли-индекса воды титрационным методом
Отрицательная проба на оксидазу свидетельствует о наличии в воде БГКП. В этом случае вычисляют коли-индекс и коли-титр с помощью стандартных (эмпирических) таблиц ГОСТа 16963-73 (см. табл. 54).
Эти таблицы предусматривают любую возможную комбинацию объемов посева, из которых выделена кишечная палочка.
Метод мембранных фильтров
Для фильтрации воды можно использовать воронку Гольдмана вместимостью 700-800 мл.
Первый день исследования
В воронку смонтированного и простерилизованного фильтровального прибора Зейтца наливают отмеренный объем исследуемой воды. С помощью насоса создают вакуум в приемном сосуде (обычно воду фильтруют через фильтры № 2 и 3). По окончании фильтрации стерильным или обожженным в огне пинцетом снимают фильтр и накладывают его на среду Эндо в чашке Петри так, чтобы поверхность с осевшими на ней микробами была обращена вверх (на одну чашку можно помещать 3-4 мембранных фильтра).
Посевы инкубируют в термостате при температуре 37° С 18-24 ч.
Второй день исследования
Чашки с посевами (фильтрами) вынимают из термостата. Отсутствие подозрительных колоний дает право дать отрицательный ответ.
Учету подлежат все красные и розовые колонии с металлическим блеском или без него. Из выросших колоний делают мазки, окрашивают по Граму (рис. 56).
Рис. 56. Определение коли-индекса воды методом мембранных фильтров
При наличии грамотрицательных палочек ставят пробу на оксидазу. Положительная оксидазная проба дает право дать отрицательный ответ. При отрицательной оксидазной пробе производят посев на полужидкую среду с глюкозой и индикатором или на среду ГПС с бродильными трубками – для выявления ферментации углевода до кислоты и газа. При наличии кислоты и газа вычисляют коли-индекс. Например, на всех фильтрах, находящихся на среде Эндо, выросло 3 колонии, пропущено через фильтр было 300 мл воды.
Расчет. 300 мл – 3 колонии
1000 мл – х
х = 10; коли-индекс 10
Примечание. Титрационный метод более точный и может быть использован при наличии в воде примесей. Метод мембранных фильтров экономичнее и дает возможность дать ответ на 2-й день.
Выявление свежего фекального загрязнения
Для определения наличия в воде свежих фекальных кишечных палочек производят посев воды (3-х объемов) на лактозопептонную среду с борной кислотой. Инкубируют при 43° С 24 ч. Наличие кислоты и газа свидетельствует о свежем фекальном загрязнении.
По эпидемиологическим показаниям в воде определяют сальмонеллы, шигеллы, энтеровирусы.
Примечание. Общепринятым дополнительным показателем фекального загрязнения питьевой воды являются энтерококки. При проведении бактериологического исследования определяют все группы энтерококков, хотя санитарное значение имеют преимущественно фекальные стрептококки, обнаружение которых является показателем свежего фекального загрязнения.
Контрольные вопросы
1. Какова основная задача санитарной микробиологии?
2. Что такое санитарно-показательные микроорганизмы?
3. Что такое коли-индекс и коли-титр?
4. Какие Вы знаете методы определения БГКП?
Задание
Определите общее число микробов в исследуемой пробе воды. Среда ГПС (Эйкмана).
Питательные среды
ГПС (Эйкмана) концентрированная. В 1 л воды растворяют 100 г пептона, 50 г хлорида натрия. Нагревают смесь до кипения, фильтруют, прибавляют 100 г глюкозы, устанавливают рН 7,4-7,6 и разливают по 10 мл в колбы вместимостью 250 мл, по 1 мл в 3 пробирки (концентрированной среды) и по 1 мл в 3 пробирки со средой нормальной концентрации (во всех емкостях среду до нужной концентрации доводят стерильной водой).
Примечание. При исследовании особенно загрязненных вод делают большие разведения (например, 10-6, 10-7 и т. д.).
lush bullet
Источник
Вода является естественной средой обитания многих микроорганизмов. Особую опасность для здоровья человека и животных представляют патогенные бактерии, которые могут содержаться в ней.
Источниками загрязнения воды патогенными микроорганизмами являются выделения больных животных и людей, трупы животных, сточные воды, особенно с предприятий, перерабатывающих животное сырье и др.
Длительность выживания патогенных микробов в воде зависит от их вида, условий окружающей среды и может составлять от нескольких часов до нескольких лет. Так, возбудитель сибирской язвы может сохраняться в воде до 3 лет, возбудитель туберкулеза — до 1 года, возбудитель бруцеллеза — до 100 дней.
Имеется группа болезней, для которых характерен водный путь распространения (паратифы, лептоспирозы).
Таким образом, вода может стать источником распространения инфекционных болезней, возникновения эпидемий и эпизоотий. Для санитарно-бактериологической оценки воды проводят следующие исследования:
1) определение количества МАФАнМ в 1 мл;
2) определение коли-титра (КТ) и коли-индекса (КИ);
3) обнаружение в воде патогенных микроорганизмов проводят по эпидпоказаниям. Для санитарно-микробиологического исследования пробы воды отбирают из источника в объеме не менее 500 мл. Из открытых водоемов их набирают батометром. Батометр — стерильная емкость с пробкой, в металлическом каркасе и со свинцовым грузилом. На нужной глубине пробку открывают, подтягивая ее за веревочку. Воду из рек, озер отбирают с глубины 10–15 см от поверхности, а при небольшой глубине — на расстоянии 10–15 см от дна.
Для отбора проб водопроводной воды из крана набирают 500 мл в стерильные колбы с ватной пробкой с соблюдением правил асептики. Кран предварительно стерилизуют горящим спиртовым тампоном, затем в течение 10 мин спускают воду и только потом берут пробы, которые исследуют сразу или не позднее 2 ч с момента взятия. Если это невозможно, то их хранят не более 6 ч обязательно при температуре +1…+5_С в холодильнике.
Определение количества МАФАнМ в водопроводной воде. В чашку Петри с соблюдением правил асептики вносят 1 мл водопроводной воды без предварительного разведения, заливают расплавленным и охлажденным до температуры +50_С МПА (методом горячей заливки). Посевы инкубируют 24–48 ч в термостате при температуре +30_С. После указанного срока приступают к подсчету количества колоний, выросших как на поверхности, так и в глубине агара. Учитывают только те разведения, при посеве которых на чашках вырастает от 30 до 300 колоний.
При посеве воды без разведений количество бактерий в 1 мл воды будет равно количеству выросших колоний. При определении количества МАФАнМ в воде открытых
водоемов исследуемую воду предварительно разводят стериль –1:10-1 до 1 : 10-4, из двух последних разведений вносят по 1 млв стерильные чашки и заливают расплавленным и охлажденным до температуры +50_С МПА. После инкубирования притемпературе +30_С в термостате в течение 24–48 ч подсчитывают количество колоний, умножают на степень разведения водыи определяют количество бактерий в 1 мл воды открытых водоемов. Учету подлежат чашки Петри, в которых выросло от 30до 300 колоний. Колонии считают в каждой чашке отдельно,определяют среднеарифметическое число по двум чашкам. Полученное число умножают на степень разведения исследуемойводы и получают число бактерий в 1 мл воды.
Определение коли-титра (КТ) и коли-индекса (КИ) воды.
Колититромназывают наименьший объем воды, в котором обнаружена одна кишечная палочка.
Колииндекспоказывает число кишечных палочек в 1000 мл воды.
Кишечная палочка является постоянным обитателем кишечника человека и животных, следовательно, ее присутствие в питьевой воде является индикатором фекального загрязнения, поэтому она отнесена к санитарно-показательным микроорганизмам. Чем выше концентрация бактерий группы кишечной палочки, тем вероятнее присутствие в исследуемой воде патогенных бактерий, таких как сальмонеллы, возбудители дизентерии и холеры. Показатели КТ и КИ указывают на санитарное состояние воды, ее пригодность в качестве питьевой.
Коли-титр и коли-индекс определяют двумя методами:
1) метод бродильных проб;
2) метод мембранных фильтров.
При исследовании чистой воды удобнее пользоваться методом мембранных фильтров. Если вода содержит механическиечастицы, затрудняющие процесс фильтрации, лучше пользоваться бродильным методом.
Метод бродильных проб.Суть этого метода заключается в посеве определенных объемов исследуемой водыв питательные среды накопления с индикатором и поплавками, инкубации ее при температуре +37_С, с последующим пересевом из забродивших пробирок на среду Эндо, дифференциацией выросших колоний и вычислении коли_титра воды по нормативам.
Данный метод основан на ферментативной способности БГКП расщеплять при помощи ферментов лактозу или глюкозу до кислоты и газа. Исследуемая вода засевается в различных объемах в глюкозопептонную среду с индикатором и поплавками, при наличии кишечной палочки появляется помутнение, меняется цвет индикатора (желтый цвет переходит в красный) и появляются пузырьки газа в поплавках. Воду методом бродильных проб исследуют в три этапа (три дня):
Первый день.Засевают водопроводную воду в объеме 333 мл (три объема по 100 мл, три — по 10 мл и три — по 1 мл). При этом вода в объемах по 100 и 10 мл засевается в колбы и пробирки соответственно — с 10 и 1 мл концентрированной ГПС, а посев воды в объеме 1 мл— в пробирки с 10 мл среды с нормальной концентрацией (готовят как концентрированную, но количество всех ингредиентов, кроме воды, уменьшают в 10 раз). Посевы исследуемой воды в средах ГПС культивируют в термостате 24 ч при температуре +37_С.
Второй день.Ведется учет результатов посева разных объемов воды, при котором:
-отсутствие помутнения, образования кислоты и газа в колбах и пробирках после посева воды свидетельствуют об отсутствии кишечной палочки в исследуемом объеме воды;
-помутнение питательной среды, изменение цвета индикатора на красный и появление газа в поплавках говорят о наличии кишечной палочки. Из каждого забродившего посева петлей делают пересев штрихом на агар Эндо, разделенный на сектора в чашках Петри, таким образом, чтобы появились изолированные колонии. Посевы культивируют 24 ч при температуре +37_С.
Третий день.Ведется учет результатов посева на агаре Эндо, при котором:
-отсутствие роста на агаре Эндо или наличие колоний, не характерных для БГКП, говорит о том, что кишечной палочки в посевах нет;
-из колоний, характерных для бактерий БГКП (красных с металлическим оттенком), готовят мазки, окрашивают по Граму, микроскопируют. Идентифицируют культуру по оксидазному тесту, положительную реакцию на этот тест дают БГКП, которые не учитываются. Наличие в мазках грамотрицательных бактерий с отрицательной реакцией на оксидазный тест позволяет дать положительный ответ на присутствие БГКП в исследуемом объеме воды.
Для установления свежего фекального загрязнения делают посев воды в желчно-лактозную среду с бриллиантовым зеленым. Посевы культивируют при температуре +43_С для дифференциации кишечной палочки от хладнокровных, не растущих при такой высокой температуре. Наличие мути и газа указывает на присутствие в воде бактерий — показателей свежего фекального загрязнения.
Источник