Выделение чистой культуры кишечной палочки
Метод Дригальского. Первый этап. Рассев смеси на чашку с МПА шпателем.
Посев проводим несколько измененным методом Дригальского. Вместо трех чашек Петри с МПА берем одну чашку.
Бактериологическую петлю стерилизуйте в пламени горелки. С помощью стерильной петли на поверхность питательной среды в чашке нанесите каплю исследуемого материала в 3-х точках: первые две точки – ближе к стенке чашки, а третью точку – в центр питательной среды.
Центральную каплю распределите по поверхности питательной среды с помощью прокаленного на пламени горелки и охлажденного шпателя сначала в одном направлении, затем перпендикулярно в другом направлении.
На чашке с помощью карандаша по стеклу напишите фамилию, номер группы и дату.
Чашку Петри поставьте в специальный цилиндр вверх дном, чтобы конденсационная вода, образовавшаяся на крышке чашки, не стекала на поверхность среды и не помешала получить изолированные колонии.
Чашки выдерживают в термостате в течение 1 – 7 суток при температуре 37°С.
8. Контроль освоения заданий по самостоятельной контактной работе.
8.1. Выполнить тестовые задания.
8.1.1. Выберите один наиболее правильный ответ.
1. В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ИСТОЧНИКА УГЛЕРОДА, МИКРООРГАНИЗМЫ БЫВАЮТ
1) литотрофы
2) фототрофы
3) хемотрофы
4) автотрофы
2. ШТАММ – ЭТО КУЛЬТУРА МИКРООРГАНИЗМОВ ВЫДЕЛЕННАЯ
1) из объектов внешней среды
2) одного вида, выделенная из разных источников или в разное время
3) из разных источников в разное время
4) из организма животного или человека
3. ОСНОВОЙ ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД ЯВЛЯЕТСЯ
1) агар-агар
2) глюкоза
3) крахмал
4) глицерин
4. ЭЛЕКТИВНЫЕ ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ ПРИМЕНЯЮТ для
1) предупреждения отмирания патогенных бактерий
2) первичного посева материала
3) накопления бактерий определённой группы
4) пересева со сред обогащения
8.1.2. Установите соответствие.
5. Установите соответствие между фазами кривой роста бактерий в жидкой питательной среды и их характеристикой: к каждой позиции, данной в первом столбце, подберите соответствующую позицию из второго столбца.
| характеристика | фазы кривой роста бактерий |
| А) Наступает вследствие накопления кислых продуктов обмена или в результате автолиза под влиянием собственных ферментов Б) Постоянная максимальная скорость деления клеток, которая зависит от вида бактерий и питательной среды. В) Происходит адаптация бактериальных клеток к новым условиям культивирования, идет синтез индуцибельных ферментов. Г) Снижение темпов размножения и прекращение увеличения числа клеток в результате истощения среды и накопления в ней токсических продукты метаболизма. | 1. Лаг-фаза 2. Экспоненциальная фаза 3. Стационарная фаза 4. Фаза отмирания |
6. Установите соответствие между типами консистенции питательной среды и их составом: к каждой позиции, данной в первом столбце, подберите соответствующую позицию из второго столбца.
| состав | консистенция питательной среды |
| А) Мясопептонный бульон, пептонная вода, сахарный бульон. Б) 0,5 % мясо-пептонный агар. В) Питательная желатина, картофель, свернутая сыворотка, свернутый яичный белок. | 1. Жидкие питательные среды 2. Полужидкие питательные среды 3. Плотные питательные среды |
8.1.3. Для каждого вопроса один или несколько ответов являются правильными. Выберите ответ:
| Верно | 1, 2, 3 | 1, 3 | 2, 4 | 1, 2, 3, 4 |
| Ответ | А | Б | В | Г |
7. Для выделения микроорганизмов предпочтительно использовать питательные среды
1) простые
2) элективные
3) сложные
4) среды обогащения
8. Для контроля качества питательной среды в практических лабораториях чаще применяют
1) определение аминного азота
2) титрованный посев контрольного штамма
3) определение рН
4) определение окислительно-восстановительного потенциала
9. Для выращивания микроорганизмов наиболее важным является
1) соблюдение температурного режима
2) обеспечение определенной степени аэрации среды
3) определенное значение рН среды
4) определение окислительно-восстановительного потенциала среды
10. Для выделения чистых культур используют
1) посев исследуемого материала методом «штрих с площадкой»
2) посев исследуемого материала на элективные среды
3) заражение восприимчивых животных
4) прогревание исследуемого материала для выделения бацилл
8.2. Решить ситуационные задачи.
Задача 1. По типу питания и способу получения энергии бактерии делятся на разные группы. По источникам углерода бактерии делят на два типа: аутотрофы и гетеротрофы. По источникам энергии различают фототрофы и хемотрофы.
К какой группе относятся микроорганизмы, вызывающие инфекционные заболевания человека? Обоснуйте;
Какой тип взаимоотношений сложился между возбудителями инфекционных заболеваний и организмом человека.
Задача 2. На первом этапе бактериологического метода исследования проводится посев исследуемого материала на плотные питательные среды с целью получения изолированных колоний.
Каким способом можно сделать эту работу, если имеется: исследуемый материал в пробирке, три чашки Петри с плотной питательной средой, стерильный шпатель и бактериологическая петля?
Какой принцип лежит в основе этого метода посева?
Задача 3. На чашках первичного посева получен сплошной рост микроорганизмов.
Можно ли переходить к следующему этапу работы? Какой метод был использован? Что необходимо сделать?
Ответ:
Задача 4. При посеве спинно-мозговой жидкости, полученной от обследуемого с предварительным диагнозом «Менингит» выявить рост микроорганизмов на питательных средах не удалось.
Можно ли приготовить универсальную питательную среду, на которой росли бы, если не все, то большинство микроорганизмов?
Назовите примеры общеупотребляемых сред?
Ответ:
Практическое занятие № 5
Источник
МУК 4.2.992-00
Дата введения 2001-02-04
1. РАЗРАБОТАНЫ
Федеральным центром госсанэпиднадзора Минздрава России
(Л.Г.Подунова, Н.С.Кривопалова, Р.С.Сорокина), Центром
госсанэпиднадзора в Тульской области (Л.И.Шишкина, Т.А.Попова,
А.Я.Сыпченко, Н.М.Корнеева), Государственным научным центром
прикладной микробиологии (М.В.Храмов).
2. УТВЕРЖДЕНЫ Главным
государственным санитарным врачом Российской Федерации – Первым
заместителем министра здравоохранения Российской Федерации
Г.Г.Онищенко 4 ноября 2000 г.
3. ВВЕДЕНЫ ВПЕРВЫЕ.
1.
Область применения
1. Настоящие методические
указания предназначены для бактериологических лабораторий центров
государственного санитарно-эпидемиологического надзора, других
учреждений системы здравоохранения Российской Федерации,
осуществляющих бактериологическую диагностику острых кишечных
инфекций с гемоколитом и развитием гемолитико-уремического
синдрома, а также обследование контактных в очагах заболевания и
контроль за качеством продовольственного сырья и пищевых
продуктов.
2. Методические указания
определяют методы обнаружения, выделения и идентификации
энтерогеморрагической кишечной палочки Е. coli О157:Н7 и
разработаны в связи с отсутствием в настоящее время нормативных
документов по данному разделу бактериологических исследований.
3. Методические указания
являются обязательными при контроле продуктов детского питания,
молочных и мясных продуктов в ходе проведения противоэпидемических
мероприятий при возникновении вспышек, а также осуществления
санитарно-эпидемиологического надзора.
4. Настоящие методические
указания созданы с целью унификации и дальнейшего совершенствования
бактериологических методов выделения и идентификации
энтерогеморрагической кишечной палочки Е. coli О157:Н7 в связи с
регистрацией данной патологии на территории Российской Федерации, а
также роста заболеваемости вспышечного характера и спорадической за
рубежом.
2.
Сущность метода
Методические указания
содержат описание микробиологического исследования с целью
выделения и идентификации энтерогеморрагической кишечной палочки Е.
coli О157:Н7 из биоматериала от больных неосложненными диареями,
острыми кишечными инфекциями с гемоколитом и развитием
гемолитико-уремического синдрома, от контактных в очаге, а также
пищевых продуктов, сырья.
Предлагаемый
дифференциально-диагностический метод основан на использовании
некоторых особенностей биохимических свойств данного
микроорганизма: отсутствии фермента -D-глюкуронидазы и способности
ферментировать сорбитол, а также на наличии у Е. coli О157:Н7
такого “маркера”, как продукция веротоксинов (VT1, VT2).
Для осуществления
возможности практического использования данной методики в течение
короткого периода времени разработана отечественная питательная
среда “Сорбитол Е. coli О157:Н7 агар” (ФС 42-0027-00) для выделения
Е. coli О157:Н7 из клинического материала, объектов окружающей
среды (разработчик – Государственный научный центр прикладной
микробиологии, отделение “Питательные среды”, г.Оболенск
Серпуховского района Московской области), а также созданы
диагностические сыворотки для реакции агглютинации и методика
определения веротоксинов в клиническом материале.
Огромный интерес,
проявляемый к острым кишечным инфекциям с гемолитико-уремическим
синдромом (ГУС) со стороны научных центров и практического
здравоохранения за рубежом и в нашей стране, закономерен.
Количество регистрируемых
заболеваний острыми кишечными инфекциями с гемолитико-уремическим
синдромом, как вспышечного характера, так и спорадических, ежегодно
возрастает (США, Канада, Финляндия, Япония, Европа).
Этиологическим фактором
этих заболеваний являются энтерогеморрагические кишечные палочки,
продуцирующие веротоксины (шигаподобные токсины). Они представлены
довольно большим разнообразием серологических вариантов, из которых
Е. coil О157:Н7 имеет наибольшее эпидемиологическое значение в
качестве причин неосложненных диарей и кровавого поноса с
последующим развитием ГУС.
К
настоящему времени биология эшерихии Е. соli О157:Н7,
эпидемиология, патогенез и диагностика связанных с ней заболеваний
достаточно изучены.
Первые сведения о
выделении Е. coli О157:Н7 и регистрация данной патологии в нашей
стране имели место в Тульской области, где диагностика острых
кишечных инфекций с гемолитико-уремическим синдромом начата с конца
1996 года.
Результаты выделения Е.
coli О157:Н7 из клинического материала от детей, больных ОКИ,
сырья, пищевых продуктов (сырого мяса, молока) получены в 1997-99
гг.: установление этиологического фактора (Е. coli О157:Н7) случаев
острых кишечных инфекций, осложненных гемолитико-уремическим
синдромом, составило в Тульской области 43%, высеваемость Е. coli
О157:Н7 из пищевых продуктов и сырья 1,96%; высеваемость культур от
животноводов и доярок ферм – 9%.
Наибольшему риску
подвержены дети до 5 лет и пожилые люди.
Естественным резервуаром
бактерий Е. coli О157:Н7, патогенных для человека, служит крупный
рогатый скот, овцы. Наиболее частый путь распространения этой
инфекции – пищевой. Основным фактором передачи является сырая
говядина, особенно мясной фарш, мясные полуфабрикаты, прошедшие
недостаточную термическую обработку, сырое молоко. Отмечены случаи
передачи возбудителя через воду.
3.
Нормативные ссылки
3.1. “Основы
законодательства Российской Федерации об охране здоровья граждан”
от 22.07.93 г.N 5487-1.
3.2. Федеральный
закон “О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения” от 30
марта 1999 г. N 52-ФЗ.
3.3. СанПиН
2.3.2.560-96 “Гигиенические требования к качеству и безопасности
продовольственного сырья и пищевых продуктов”*.
___________________
*
Действуют СанПиН
2.3.2.1078-01. – Примечание “КОДЕКС”.
3.4. ГОСТ
26668-85 “Продукты пищевые и вкусовые. Методы отбора проб для
микробиологических исследований”.
3.5. ГОСТ
26669-85 “Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для
микробиологических анализов”.
3.6. ГОСТ
26670-91 “Продукты пищевые. Методы культивирования
микроорганизмов”.
3.7. ГОСТ
10444.1-84 “Консервы. Приготовление растворов, красок, индикаторов,
питательных сред, применяемых в микробиологическом
анализе”.
3.8. ГОСТ Р 50474-93 “Продукты пищевые. Методы
выявления и определения количества бактерий группы кишечных палочек
(колиформных бактерий)”.
3.9. ГОСТ Р 50480-93 “Продукты пищевые. Методы
выявления бактерий рода Salmonella”.
3.10. ГОСТ
9225-84 “Молоко и молочные продукты. Методы микробиологического
анализа”.
3.11. ГОСТ
9792-73 “Колбасные изделия и продукты из свинины, баранины,
говядины и мяса других видов убойных животных и птиц. Правила
приемки и методы отбора проб”.
3.12. ГОСТ
9958-81 “Изделия колбасные и продукты из мяса. Методы
бактериологического анализа”.
3.13. ГОСТ
21237-75 “Мясо. Методы микробиологического анализа”.
3.14. ГОСТ
4288-76 “Изделия кулинарные и полуфабрикаты из рубленого мяса.
Правила приемки и методы испытания”.
3.15. ГОСТ Р 50396.0-92 “Мясо птицы, субпродукты и
полуфабрикаты птичьи. Методы отбора проб и подготовка к
микробиологическим исследованиям”.
3.16. ГОСТ
7702.2.2-93 “Мясо птицы, субпродукты и полуфабрикаты птичьи. Методы
выявления и определения количества бактерий группы кишечных
палочек”.
3.17. ГОСТ
7702.2.3-93 “Мясо птицы, субпродукты и полуфабрикаты птичьи. Методы
выявления сальмонелл”.
3.18. МУ
04-723/3 от 17.12.84 г. Методические указания по
микробиологической диагностике заболеваний, вызываемых
энтеробактериями.
3.19. Инструкция к
применению “Набора реагентов для выявления веротоксина у эшерихий”
(фирма “Seiken”, Япония).
4.
Методы забора, доставки проб клинического материала от больных и
контактных
Важным условием выделения
эшерихий Е. coli О157:Н7 из клинического материала является отбор и
доставка его в лабораторию в возможно ранние сроки: оптимальными
сроками являются 1-3 день от момента заболевания.
У
больных интенсивность выделения возбудителя снижается, достигая 50%
и более низкого уровня через 5-8 дней от начала заболевания.
Гемолитико-уремический синдром обычно развивается спустя, как
минимум, одну неделю после первых признаков диареи, и вероятность
обнаружения возбудителя к этому времени существенно
уменьшается.
Материалом для
бактериологического исследования служат в первую очередь
испражнения, моча.
Испражнения собирают в
консервант, в качестве которого можно использовать
фосфатно-буферную или глицериновую смеси. В случае доставки
материала в течение 2 часов с момента забора нативные испражнения
отбирают в стерильные флаконы.
При обследовании
контактных лиц с целью выявления бактерионосителей возможно взятие
материала ректальными тампонами, проволочными петлями.
Мочу после туалета
наружных половых органов собирают в стерильную посуду. Перед
посевом мочу центрифугируют и засевают осадок. В случае небольшого
количества осадка засевают нативную мочу в среду обогащения двойной
концентрации в равных объемах (приложение 1).
5.
Методы подготовки пищевых продуктов для бактериологического
исследования и схемы посева на питательные среды
Методы отбора проб,
хранение и подготовка их к анализу регламентированы в действующих
нормативных документах на конкретный вид продукта (раздел 3
“Нормативные ссылки”).
Проведение испытаний
различных пищевых продуктов устанавливает единый метод выявления в
определенной навеске пищевого продукта колиформных бактерий в
соответствии с ГОСТ Р 50474-93
“Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества
бактерий группы кишечных палочек (колиформных бактерий)”. По
классификации кишечных палочек Е. coli 0157:Н7 относится к
энтерогеморрагическим, энтеропатогенным кишечным палочкам, поэтому
выявление ее как патогена необходимо проводить в 25 г продукта.
Возможно выявление Е. coli О157:Н7 в других объемах,
регламентированных нормативной документацией на конкретный вид
продукта, а также СанПиН
2.3.2.560-96 “Гигиенические требования к качеству и
безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов”
(приложения 2, 3).
6.
Проведение анализа
Принципы
бактериологического исследования с целью выделения Е. coli О157:Н7
не отличаются от общепринятых для возбудителей острых кишечных
инфекций и включают методы классического бактериологического
исследования, основанные на выделении чистой культуры
микроорганизма и последующей его идентификации по
культурально-морфологическим, биохимическим, антигенным свойствам.
Основным критерием отнесения штамма к группе энтерогеморрагических
эшерихий являются данные, подтверждающие продукцию веротоксинов.
Штаммы, не продуцирующие токсинов, не могут считаться возбудителями
эшерихиозов у людей.
6.1. Посев клинического
материала с целью выделения Е. coli О157:Н7 проводится на
питательную среду Сорбитол Е. coli О157:Н7 агар (прямой посев) и в
соотношении 1:5 в среды накопления, которыми могут служить бульон
лактозный с бриллиантовым зеленым и желчью (ГОСТ Р 50474-93), GN Enrichment Broth
асс. to HAJNA (Cat. N 10756, фирма “MERCK”, Германия). При
отсутствии нативного материала испражнения, забранные в консервант,
засевают в среду обогащения двойной концентрации (приложение
1).
6.2. Посев пищевых
продуктов для выявления БГКП (колиформных бактерий) в определенной
навеске продукта проводится в соответствии с ГОСТ Р 50474-93. Дополнительной
питательной средой для выявления Е. coli О157:Н7 является Сорбитол
E. coli О157:Н7 агар (приложение 2), потому что плотная питательная
среда, используемая для выделения колиформных бактерий (Эндо), не
может быть использована для целенаправленного поиска E. coli
О151:Н7, т.к. данный микроорганизм разлагает лактозу подобно другим
эшерихиям.
6.3. Подготовку пищевых
продуктов для выявления E. coli О157:Н7 с применением сред
обогащения осуществляют в соответствии с ГОСТ Р 50480-93 “Продукты пищевые.
Методы выявления бактерий рода Salmonella”, но в качестве сред
обогащения могут быть использованы среда Кесслера, трипказо-соевый
бульон, бульон лактозный с бриллиантовым зеленым и желчью,
Грам-негативный бульон (GN-бульон). После термостатирования посевов
при 37 °С в течение 18-24 ч проводят высев на плотную среду
Сорбитол Е. coli О157:Н7 агар, обладающую дифференциальными и
селективными свойствами (приложение 3).
Отличительным
биохимическим свойством Е. coli О157:Н7 является отсутствие
способности ферментировать сорбитол. Для выделения штаммов Е. coli
О157:Н7 необходимо использовать Сорбитол Е. coli О157:Н7 агар или
среды зарубежного производства: Fluorocult Е. coli О157:Н7 Agar (Cat. N 1.04036);
Sorbitol MacConkey Agar (SMAC-agar) Cat. N 1.09207;
Fluorocult HC Agar acс. to SZABO Cat. N 1.09206 (фирма
“MERCK”, Германия).
Характеристика роста Е.
coli О157:Н7 на плотных питательных средах представлена в
табл.1.
Таблица
1
Характеристика роста Е. coli О157:Н7 на плотных
питательных средах
Питательная | Характер |
Среда ЭНДО | Колонии |
Сорбитол Е. coli О157:Н7 | Колония |
Fluorocult Е. coli О157:Н7 | Прозрачные или |
Простой питательный | Колонии |
Агар Плоскирева, | Роста нет. |
Кровяной агар | Колонии |
Если на чашке с Сорбитол
Е. coli О157:Н7 агаром выросли 1-2 сорбитол-отрицательных колонии,
то серологические исследования проводят после посева на одну из
сред для первичной дифференциации: агар Клиглера, Олькеницкого,
Ресселя. В случае роста на чашке Петри однотипной культуры с 3-5
колониями проводят серологическую идентификацию на стекле с “О”- и
“Н”-сыворотками к антигенам Е. coli О157:Н7, либо с латексным
антительным диагностикумом.
Не менее 5
сорбитол-отрицательных колоний пересевают на среду для первичной
идентификации. Посевы инкубируют в термостате при 37 °С 18-24 часа.
При получении на следующий день результатов, подтверждающих
принадлежность культуры к роду эшерихий (ферментация глюкозы и
лактозы с образованием кислоты и газа, отсутствие HS), проводят дальнейшую биохимическую и
серологическую идентификацию (приложения 2, 3).
7.
Биохимические свойства и серологическая идентификация Е. соli
O157:Н7
Серологическая
идентификация предусматривает выявление “О”- и “Н”-антигенов у
эшерихий Е. coli О157:Н7.
Определение “О”- и
“Н”-антигенов проводится в обычной реакции агглютинации на стекле с
эшерихиозными сыворотками к Е. соli O157:Н7, выпускаемыми АООТ
“Биомед” имени И.И.Мечникова (Московская область, Красногорский
район, с.Петрово-Дальнее) или латексным антительным диагностикумом
производства ГНЦ ПМ (Московская область, Серпуховской район,
г.Оболенск). Реакция агглютинации осуществляется в соответствии с
наставлениями по применению данных сывороток.
Необходимо отметить, что
Е. coli О157:Н7 имеет антигенные связи с другими эшерихиями
(табл.2).
Таблица
2
Антигенные связи Е. соli О157:Н7 и других эшерихий
Е. coli | Наименование | |
О157 | Н7 | |
О2-О17 | – | – |
О19-О49 | ||
О51-О54 | ||
О56-О115 | ||
О117-О164 | ||
О50 О116 | + | – |
О1; О18; О55 | – | + |
О157:Н7 | + | + |
Все штаммы, дающие
положительную реакцию агглютинации, подлежат обязательной
биохимической идентификации для подтверждения видовой
принадлежности. Биохимические свойства Е. coli О157:Н7 отражены в
табл.3.
Таблица
3
Основные биохимические свойства Е. coli О157:Н7
N | Тест или | Наименование | |
Е. соli | Е. coli | ||
1 | Сорбитол | – | + |
2 | -D-глюкуронидаза | – | + |
3 | Цитрат Симмонса | – | – |
4 | Мочевина | – | – |
5 | Малонат натрия | – | – |
6 | Сероводород | – | – |
7 | Фенилаланиндезаминаза | – | |
Источник