Жидкая питательная среда для кишечной палочки
Глюкозо-пептонная среда (Эйкмана) (ГПС)
Глюкозо-пептонная среда готовится в двух модификациях: концентрированная и разведенная. Концентрированная глюкозо-пептонная среда. К 1 л водопроводной воды прибавляют 100 г пептона, 100 г глюкозы и 50 г хлористого натрия. Сначала в воде растворяют пептон и соль, кипятят, фильтруют и, добавив в фильтрат глюкозу, устанавливают pH 7,4. Если необходимо, среду подщелачивают. После установления pH среду кипятят; если образовался осадок, фильтруют.
Концентрированную среду разливают в бродильные сосуды 1 и пробирки с поплавками с таким расчетом, чтобы при посеве среда разбавлялась посевным материалом в 10 раз. Для посева 100 мл воды нужно в бродильный сосуд поместить 10 мл ГПС, а в пробирки для посева 10 мл воды вливают по 1 мл ГПС. Стерилизация концентрированной глюкозо-пептонной среды осуществляется в кипятильнике Коха по 30 мин в течение трех дней.
В практической работе для сокращения срока стерилизации глюкозо-пептонной среды можно рекомендовать следующий режим. Температуру автоклава вначале доводят до 120°С и стерилизуют среду при этой температуре 5 мин. Постепенно снижают давление в автоклаве, выпуская пар и прекратив нагрев, до 0 ат (что соответствует температуре 100 °С) и при 100 °С (при открытом паровыпускном клапане) выдерживают среду еще 15 мин.
Разведенная глюкозо-пептонная среда содержит в 10 раз меньше всех плотных ингредиентов, чем концентрированная. Это достигается прибавлением к одной части концентрированной среды девяти частей воды. Разведенную глюкозо-пептонную среду разливают в пробирки с поплавками по 9 мл. Стерилизуют так же, как и основную среду. Используют разведенную глюкозо-пептонную среду при посеве малых количеств воды или ее разведений.
Среда Булира
При санитарной оценке воды и молока для определения в них коли-титра вместо ГПС можно применять среду Булира в разведенном и концентрированном виде.
Концентрированная среда Булира – основной раствор. Используется она в тех случаях, когда для посева берут 10 мл воды и более. К 1 л мясопептонного бульона добавляют 2,5 г маннита и после растворения устанавливают pH 6,8-7,0. Кипятят среду 10 мин, затем в горячий раствор добавляют насыщенный водный раствор нейтральрота до появления ясной вишнево-красной окраски. Среду фильтруют и разливают в бродильные сосуды и пробирки с поплавками с таким расчетом, чтобы при посеве среда разбавлялась посевным материалом в 3 раза. Обычно среды в бродильный сосуд наливают в 2 раза меньше, чем вносится посевного материала, т.е. для посева 10 мл воды в бродильный сосуд наливают 5 мл среды, для посева 100 мл воды нужно налить 50 мл среды и пр. Стерилизация среды Булира проводится в кипятильнике Коха по 30 мин в течение трех дней. Можно стерилизовать ее и в автоклаве при 120 °С в течение 15 мин.
При исследовании молока, а также при анализе воды, когда для посева берут небольшие количества продукта, готовят разведенную среду Булира: к одной части концентрированной среды приливают две части воды. Разведенную среду Булира разливают в пробирки с поплавками по 6-7 мл. Стерилизуют, как указано выше. Среда ГПС и среда Булира являются средами накопления.
Среда Кеслера
Среда Кеслера применяется для определения коли-титра в молоке и других молочных продуктах. К 1 л водопроводной воды добавляют 10 г пептона и 50 мл бычьей желчи. Смесь кипятят на водяной бане при помешивании в течение 20-30 мин, фильтруют ее через вату и в фильтрате растворяют 10 г лактозы. Объем доводят до 1 л. pH среды устанавливают 7,4-7,6, добавляют 2-4 мл 1%-ного раствора (водного) генцианвиолета на 1 л среды. В пробирки с поплавками разливают по 5 мл среды и стерилизуют 15 мин при 120 °С.
Источник
Среда Хейфеца.Выпускается в сухом виде. В состав, кроме основных питательных компонентов (вода, пептон, маннит, натрия хлорид), входят розоловая кислота, раствор метиленового синего. Готовая среда красно_фиолетового цвета, при росте кишечной палочки рН сдвигается в кислую сторону, и среда приобретает зеленоватую окраску.
ХБ.В 1000 мл воды растворяют 10 г пептона, 5 г маннита, 5 г хлорида натрия. Приготовленную смесь кипятят 15–20 мин, устанавливают рН 7,4–7,6, процеживают через бумажный фильтр, кипятят фильтрат 10 мин, охлаждают до температуры +60_С, после чего прибавляют 30 мл дрожжевого диализата, 15 мл желчи, 10 мл раствора хинозола и 10 мл 1,6%_ного спиртового раствора бромкрезола пурпурного. Среду разливают в стерильные пробирки по 7–8 мл.
Среда Кесслера.К 1000 мл дистиллированной воды добавляют 10 г пептона и 50 мл бычьей желчи. Смесь кипятят на водяной бане при помешивании в течение 20–30 мин, фильтруют через вату, добавляют 2,5 г лактозы, доводят объем дистиллированной воды до 1000 мл, устанавливают рН 7,4–7,6, добавляют 2 мл 1%_ного водного раствора генцианвиолета, разливают в пробирки с поплавками по 8–10 мл и стерилизуют при температуре +121_С в течение 10 мин. Готовая среда имеет темно-фиолетовый цвет.
Индикация сальмонелл.Навесок колбасы массой 25 г от объединенной пробы, тщательно измельченный ножницами, вносят во флакон, содержащий 100 мл среды обогащения (Мюллера, Кауфмана, хлористо-магниевой) или 225 мл селенитового бульона. Флакон встряхивают и помещают в термостат при температуре +37_С, через 24 ч петлей или пастеровской пипеткой проводят высев из среды обогащения в чашки Петри со средой Эндо, Плоскирева, Левина или ВСА. Посевы помещают в термостат при температуре +37_С на 16–24 ч. На среде Эндо, Плоскирева и Левина бактерии из рода сальмонелл образуют бесцветные колонии. На ВСА сальмонеллы образуют черные или коричневые колонии с металлическим блеском, при этом участок среды под агаром чернеет. Не менее 5 изолированных колоний, характерных для сальмонелл, пересевают на трехсахарный агар Крумвиде–Олькеницкого в модификации Ковальчука штрихом по скошенной поверхности и уколом в столбик и инкубируют при температуре +37_С в течение 12–16 ч.
При росте сальмонелл на трехсахарном агаре цвет скошенной поверхности среды розовый, столбик — желто-бурый. Газообразование устанавливают по наличию трещин и разрыву столбика агара, при образовании сероводорода питательная среда чернеет.
Другие грамотрицательные бактерии семейства энтеробактерий дают следующие изменения цвета трехсахарного агара:
-БГКП окрашивает среду в синий или сине-зеленый цвет с образованием газа или без него;
-палочка протея окрашивает среды в ярко-красный цвет (вследствие расщепления мочевины), в случае выделения Н2S может появиться черный осадок с возможным разрывом агара.
Для дальнейшей идентификации бактерий готовят мазки, которые окрашивают по Граму, микроскопируют, а также изучают антигенные свойства путем постановки РА на предметном стекле с поливалентной (или комплексной) сальмонеллезной агглютинирующей сывороткой. Далее проводят идентификацию с помощью монорецепторных О- и Н-агглютинирующих сальмонеллезных сывороток.
Обнаружение подвижных (кроме S. gallinarum и S. pullorum) грамотрицательных палочек, дающих характерный рост на элективных средах, не ферментирующих лактозу и сахарозу, сбраживающих глюкозу и маннит до кислоты и газа (S. typhisuis маннит не ферментирует), образующих Н2S и не образующих индол, дающих положительную реакцию агглютинации с комплексными, монорецепторными О- и Н-агглютинирующими сальмонеллезными сыворотками, указывает на выделение бактерий из рода сальмонелл.
Индикация протеяв Н_форме проводится внесением исследуемого продукта в конденсат свежескошенного МПА (метод Щукевича). Посевы помещают в термостат на 18–24 ч при температуре +37_С. При наличии в исследуемом продукте протея подвижная палочка поднимается вверх по скошенной поверхности агара, образуя вуалеобразный голубоватый налет. Культура издает характерный гнилостный запах.
Обнаружение полиморфных грамотрицательных палочек, подвижных, сбраживающих глюкозу и мочевину, не ферментирующих лактозу и маннит, указывает на наличие в продукте бактерий из рода протея.
Индикация стафилококкав исследуемом продукте основана на изучении морфологии, культуральных свойств и способности некоторых стафилококков ферментировать лецитиназу и коагулировать цитратную плазму крови кролика под воздействием фермента коагулазы.
Вначале исследуемый продукт разводят 1 : 10, вносят в МПБ, содержащий 6,5% натрия хлорида. Через сутки после инкубирования в термостате проводят пересев на молочно-солевой агар для изучения наличия пигмента и на желточно-солевой агар для выявления лецитиназной активности.
Посевы выдерживают 24 ч в термостате и сутки при комнатной температуре, затем учитывают результат: на поверхности питательной среды стафилококки образуют слегка выпуклые круглые колонии с ровными краями, т. е. S-формы; на желточно-солевом агаре вокруг колоний стафилококков появляется «радужный венчик», что является одним из признаков их патогенности (лецитовителазная активность).
Не менее чем из 5 типичных колоний готовят препараты, которые окрашивают по Граму и микроскопируют. При наличии стафилококков обнаруживают грамположительные кокки, располагающиеся в виде беспорядочных кучек и гроздьев винограда. Для подтверждения патогенности выделенных стафилококков ставят реакцию плазмокоагуляции по следующей методике: в пробирку с 0,5 мл цитратной плазмы крови кролика, разведенной физраствором (1 : 5), вносят петлю чистой суточной культуры стафилококка и помещают в термостат при температуре +37_С. Реакцию плазмокоагуляции предварительно учитывают через 3–4 ч (осторожно наклоняя, не встряхивая пробирку). В сомнительных случаях пробирки оставляют в термостате для окончательного учета через 24 ч. Реакцию считают положительной, если плазма коагулирует в сгусток (реакцию подвижная палочка поднимается вверх по скошенной поверхности агара, образуя вуалеобразный голубоватый налет. Культура издает характерный гнилостный запах.
Обнаружение полиморфных грамотрицательных палочек, подвижных, сбраживающих глюкозу и мочевину, не ферментирующих лактозу и маннит, указывает на наличие в продукте бактерий из рода протея.
Индикация стафилококкав исследуемом продукте основана на изучении морфологии, культуральных свойств и способности некоторых стафилококков ферментировать лецитиназу и коагулировать цитратную плазму крови кролика под воздействием фермента коагулазы.
Вначале исследуемый продукт разводят 1 : 10, вносят в МПБ, содержащий 6,5% натрия хлорида. Через сутки после инкубирования в термостате проводят пересев на молочно-солевой агар для изучения наличия пигмента и на желточно-солевой агар для выявления лецитиназной активности.
Посевы выдерживают 24 ч в термостате и сутки при комнатной температуре, затем учитывают результат: на поверхности питательной среды стафилококки образуют слегка выпуклые круглые колонии с ровными краями, т. е. S-формы; на желточно-солевом агаре вокруг колоний стафилококков появляется «радужный венчик», что является одним из признаков их патогенности (лецитовителазная активность).
Не менее чем из 5 типичных колоний готовят препараты, которые окрашивают по Граму и микроскопируют. При наличии стафилококков обнаруживают грамположительные кокки, располагающиеся в виде беспорядочных кучек и гроздьев винограда.
Для подтверждения патогенности выделенных стафилококков ставят реакцию плазмокоагуляции по следующей методике: в пробирку с 0,5 мл цитратной плазмы крови кролика, разведенной физраствором (1 : 5), вносят петлю чистой суточной культуры стафилококка и помещают в термостат при температуре +37_С. Реакцию плазмокоагуляции предварительно учитывают через 3–4 ч (осторожно наклоняя, не встряхивая пробирку). В сомнительных случаях пробирки оставляют в термостате для окончательного учета через 24 ч. Реакцию считают положительной, если плазма коагулирует в сгусток (реакцию оценивают по степени плотности сгустка от одного до четырех плюсов).
Индикация сульфитредуцирующих клостридий (СРК)в колбасе основана на учете специфического роста клостридий в железосульфитсодержащих средах. При взаимодействии натрия сульфита с хлоридом железа образуется сульфат железа, который вызывает почернение питательной среды.
Для выявления СРК 1 мл исследуемой взвеси стерильной пипеткой вносят в пробирку с 9 мл жидкой сульфит-циклосериновой среды или среды Вильсон–Блера. Затем проводят последовательные пересевы на аналогичные объемы среды и получают возрастающие 10_кратные разведения суспензии. Посевы выдерживают 18–20 ч при температуре +37_С, при наличии СРК среда чернеет.
Для подтверждения принадлежности выделенных культур к клостридиям проводят пересев на поверхность агаризованной плотной среды Вильсон–Блера и инкубируют в анаэробных условиях при температуре +37_С в течение 24–48 ч. Отбирают типичные колонии и изучают микроорганизмы по морфологическим и некоторым культурально-ферментативным свойствам, в частности, по отрицательной реакции на каталазу.
Если в посевах (в 4 колониях из 5) обнаружены СРК, спорообразующие палочки, грамположительные, каталаза-отрицательные, способные расти в анаэробных условиях, то делают заключение о наличии в продукте СРК по максимальному разведению суспензии, в посеве которого наблюдается почернение среды. Например, если характерные изменения наблюдаются в пробирках с разведением 10–1, то считают, что в 1 г исследуемого продукта содержится 10 клеток, при аналогичных изменениях в пробирках с разведением 10–2 — 100 клеток.
При получении неудовлетворительных результатов микробиологического анализа готовой продукции по требованию контролирующих организаций проводят исследование вспомогательных материалов при постоянном входном контроле.
Источник
Питательная среда Мерк Миллипор (Merck Millipore)
Синие колонии – Escherichia coli; красные колонии – Citrobacter freundii
Селективный агар для одновременного определения и подсчета колиформных бактерий и E.coli в питьевой воде и термически обработанных продуктах.
Хромогенный агар Chromocult Coliform Agar (Мерк) для одновременного определения колиформных бактерий и E.coli в воде, продуктах, сырье, клиническом материале. Среда обеспечивает быстрый рост колиформных бактерий колоний (даже поврежденных клеток). Рост грамположительных бактерий в значительной степени ингибируется Тергитолом-7. Комбинация двух хромогенных субстратов позволяют одновременно определять колиформные бактерии и E.coli.
Характерный для колиформных бактерий фермент галактозидаза расщепляет хромогенный субстрат Salmon-GAL, что приводит к окрашиванию колоний в розовый (красный) цвет. Для идентификации E.coli используется хромогенный субстрат Х-глюкуронид, который расщепляется под воздействием характерного для E.coli фермента β-глюкуронидазы. E.coli расщепляет оба хромогенных субстрата – как Salmon-GAL, так и X-глюкуронид, что приводит к окрашиванию колоний в темно-синий (фиолетовый) цвет. E.coli четко отличается от других колиформных бактерий, колонии которых окрашены в розовый цвет. Для подтверждения E.coli возможно проведение индольного теста непосредственно на чашке, поскольку среда включает триптофан.
Инструкция
Хромогенный агар для определения колиформ и E.coli – Chromocult®Coliform Agar for microbiology, Кат.№ 110426.0500, Упаковка – 500 г
Идентификация колиформных бактерий
Фермент ß-галактозидаза колиформных бактерий расщепляет хромогенный субстрат Salmon-GAL, колонии окрашиваются в розовый (красный) цвет.
Идентификация E.coli
Фермент ß-глюкуронидаза E.coli расщепляет хромогенный субстрат X-глюкуронид. Так как E.coli расщепляет оба хромогенных субстрата, то колонии E.coli окрашиваются в темно-синий (фиолетовый) цвет и легко отличаются от других колиформных бактерий розового цвета.
Поскольку среда содержит триптофан, то можно поставить подтверждающий тест для E.coli на образование индола с реактивом Ковача.
Метод мембранной фильтрации
Одновременное определение колиформных бактерий и E.coli на хромогенном агаре Chromocult® Coliform Agar основано на специфическом окрашивании колоний.
Принцип действия
Наличие в среде пептонов, пирувата, сорбитола и фосфатного буфера обеспечивает быстрый рост колоний, даже поврежденных клеток колиформных бактерий. Рост грамположительных бактерий в значительной степени ингибируется наличием Tergitol 7, который не оказывает негативного эффекта на рост колиформных бактерий. Кроме того, компания Merck разработала новую комбинацию двух хромогенных субстратов, которые позволяют одновременно определять общие колиформные бактерии и E.coli.
Состав среды, (г/л):
Пептоны 3,0; хлорид натрия 5,0; дигидрофосфат натрия 2,2; гидрофосфат натрия 2,7; пируват натрия 1,0; триптофан 1,0; агар 10; сорбитол 1,0; Tergitol-7 0,15; хромогенная смесь 0,4.
Приготовление:
Растворить 26,5 г в 1 литре дистиллированной воды, нагревая на кипящей водяной бане. Перемешивать содержимое для полного растворения (примерно 35 мин). Среда может быть немного мутной. НЕ АВТОКЛАВИРОВАТЬ! НЕ ПЕРЕГРЕВАТЬ!
рН: 6,8±0,2 при 25оС
Примечание: Если анализируются образцы с большим количеством Pseudomonas и Aeromonas или грам-положительной микрофлоры, то необходимо добавить селективную добавку E.coli/Coliform Supplement (Кат.№1.00898.0001). Дать среде остыть до 45-50оС и добавить 1 флакон селективной добавки для определения E.coli и колиформ – E.coli/Colirorm Selective–Supplement (Кат.№1.00898.0001).
Готовые чашки со средой опалесцируют и желтоватого цвета. Хранить чашки со средой в холодильнике, в темноте. Для предотвращения от высыхания поместить чашки со средой в пластиковые мешки. Срок годности готовой среды на чашках – 6 месяцев.
Ход исследования:
Фильтровать образец воды, фильтр поместить на поверхность Chromocult Coliform Agar. Инкубировать 24 часа при 35-37оС.
При посеве продукта высевается количество 0,1-0.2 мл из соответствующего разведения на поверхность хромогенной агаризованной среды. Образцы объема 1 мл высеваются глубинным посевом – к 1 мл образца добавляется 15 мл хромогенной среды 45-50оС и перемешивается.
Учет результатов:
E.coli: темно-синие (до фиолетового) цвета колонии (реакция с Salmon-GAL и X-глюкуронидом)
Общие колиформные бактерии (ОКБ): розового (до красного) цвета колонии (реакция с Salmon-GAL) и темно-синие (до фиолетового) цвета колонии (E.coli).
Другие грамотрицательные бактерии: бесцветные, за исключением некоторых организмов, которые обладают ß-глюкуронидазной активностью. Эти колонии светло-голубого (до бирюзового) цвета.
Для подтверждения E.coli нанести каплю реактива Ковача на колонии темно-синего (до фиолетового) цвета. Если происходит изменение цвета реагента до розово-красного в течение нескольких секунд, то тест на образование индола считается положительным.
Штаммы | Цвет колоний | Salmon-GAL | X-глюкуронид | Индол |
E.coli | Темно-синий, фиолетовый | + | + | + |
Citrobacterfreundii | Розовый, красный | + | – | – |
Salmonella enteritidis | Бесцветные | – | – | – |
Enterococcus faecalis | Рост отсутствует | – | – | – |
Тест-штаммы | Инокулюм, КОЕ/чашку | Выход, % | Цвет колоний |
E.coliATCC 11775 | 30-300 | ≥ 70 | Темно-синий, фиолетовый |
Citrobacter freundiiATCC 8090 | 30-300 | ≥ 70 | Розовый, красный |
Enterobacter cloacae ATCC 13047 | 30-300 | ≥ 70 | Розовый, красный |
Aeromonas hydrophila ATCC 7966 | 1000-2000 | ≤ 1 | |
Serratia liquefaciens ATCC 27592 | 1000-2000 | ≤ 0,01 | |
Staphylococcus aureus ATCC 25923 | 1000-2000 | ≤ 0,01 | |
Lactococcus lactis ATCC 19435 | 1000-2000 | ≤ 0,01 | |
Bacillus subtilis ATCC 6633 | 1000-2000 | ≤ 0,01 |
- Скачать инструкцию – 110426 Chromocult Coliform Agar
- Скачать листовку – Chromocult Coliform Agar
- Скачать брошюру – Chromocult – хромогенная среда для энтеробактерий
Источник