Кишечная палочка для инсулина
Инсулин – это белок, который является гормоном поджелудочной железы. Действие инсулина в основном направлено на обмен углеводов и проявляется снижением уровня сахара в крови (гипогликемический эффект). Это происходит за счет того, что инсулин облегчает переход глюкозы в клетки органов и тканей, где стимулирует ее активирование путем образования глюкозо-6-фосфата.
Последний, окисляясь, обеспечивает клетки энергией. Таким образом, инсулин способствует периферическому окислению глюкозы. Наряду с этим инсулин тормозит распад гликогена в клетках печени. При этом снижаются процессы распада жиров и превращение аминокислот в глюкозу и происходит активирование синтеза жиров и белков.
При недостатке инсулина развивается тяжелое заболевание – диабет; при этом разрушается нормальный обмен веществ. Диабетики должны получать инсулин ежедневно, если этого не происходит, то развивается тяжелое состояние – диабетическая кома, и организм погибает. Потребность в инсулине огромна. Долгое время источником инсулина служили железы коров и свиней. Учитывая, что поджелудочная железа коровы весит 200-250 г, для получения 100 г кристаллического инсулина нужно 800-1000 кг исходного сырья. Понятно, что животный инсулин не мог обеспечить всех больных. Например, в 1979 г. из 60-ти млн больных диабетом во всем мире, только 4 млн получали препарат инсулина.
Инсулин построен из двух полипептидных цепей А и В длиной 20 и 30 аминокислот, последовательность которых была установлена Сэнгером в 1955 г. Синтез обеих цепей и соединение их дисульфидными связями для получения инсулина были проведены тремя коллективами исследователей в Сша, Китае и ФРГ в 1963 и 1965 гг. Однако осуществить в промышленном масштабе столь дорогостоящий и сложный синтез, который включает 170 химических реакций, оказалось трудно. Тем не менее в 1980 г. в Дании (компанией «Ново индастри») был разработан способ превращения инсулина свиньи в инсулин человека замещением остатка аланина, который является 30-й аминокислотой в цепи В на остаток треонина.
Это удалось достигнуть путем ферментативного замещения с последующей хроматографической очисткой продукта; в результате был получен однокомпонентный инсулин человека 99 %-й чистоты. Исследования двух однокомпонентных инсулинов (человеческого и свиного) показали, что они не различались по активности и по времени действия. В 1982 г. инсулин производили главным образом две компании «Эли Лилли» (85 % сбыта инсулина в США и патент на его производство с 1923 г.) и «Ново индастри» (47,5 % сбыта гормона в Европе).
В организме животного две полипептидные цепи инсулина исходно являются частями одной белковой молекулы длиной 109 аминокислот – препроинсулина. При синтезе препроинсулина в клетках поджелудочной железы первые 23 аминокислоты служат сигналом для прохождения молекулы сквозь мембрану клетки; эти аминокислоты отщепляются, образуется проинсулин длиной 86 аминокислот. Молекула проинсулина сворачивается таким образом, что начальный и конечный ее сегменты сближаются, а центральная часть молекулы удаляется с помощью ферментов.
Так образуется инсулин. Роль центральной части сводится к правильному взаимному расположению двух цепей инсулина.
Гилберт с сотрудниками выделили и-РНК из поджелудочной железы крысы, синтезировали ДНК-копию (комплементарная ДНК), которая была встроена в плазмиду E. coli в среднюю часть гена пенициллиназы (этот фермент в норме секретируется из клеток), и получили рекомбинантную плазмиду. Как показало определение последовательности ДНК, рекомбинантная плазмида содержала информацию о структуре проинсулина, но не препроинсулина.
При трансляции и-РНК в клетках кишечной палочки синтезировался гибридный белок, содержащий последовательности пенициллиназы и проинсулина. Далее отщепляли пенициллиназу и удаляли средний сегмент проинсулина действием трипсина. Позднее было показано, что полученные таким образом молекулы влияют на сахарный обмен, как гормон, выделенный из поджелудочной железы крысы.
В 1979 г. в США были синтезированы гены, кодирующие А и Б цепи инсулина. Далее каждый синтетический ген встраивали в плазмиду E. coli в конце гена -галактозидазы. После этого синтезированные полипептиды отщепляли от фермента, проводили их очистку и цепи соединяли in vitro для получения полной молекулы инсулина.
В клетках E. coli был также осуществлен биосинтез проинсулина, а не только отдельных ее цепей. Для этого на и-РНК проинсулина синтезировали ее ДНК-копию с помощью обратной транскриптазы (ДНК-полимераза). Этот способ имеет серьезное преимущество, поскольку различные этапы экстракции и выделения гормона сведены к минимуму. С помощью этого метода был получен высокий выход гормона -200 г на 1000 л культуральной жидкости (это эквивалентно количеству инсулина, выделенного из 1600 кг поджелудочной железы животных).
Исследователям из компании «Генентек» потребовалось 10 месяцев, чтобы в сентябре 1978 г. получить инсулин человека в специально сконструированном штамме кишечной палочки. Этот инсулин прошел самые серьезные и длительные испытания, которые показали, что он не вызывает никаких побочных явлений, как инсулин животных (у одного из каждых 20-ти больных инсулин животных вызывает аллергию; часто наблюдаются также расстройства почек и зрения ).
Кроме того, при длительном применении препарат не вызывал отрицательных иммунологических реакций.
Технология производства инсулина в бактериальных клетках имеет огромные преимущества перед получением инсулина из поджелудочной железы животных: не зависит от перебоев или количества сырья, конечный продукт всегда имеет одинаковый состав и степень чистоты.
В октябре 1982 г. был налажен выпуск «хемулина» (препарата синтетического инсулина человека) фирмой «Эли Лилли», которая затратила 100 млн долларов, чтобы начать поставку продукта на рынок.
Л.В. Тимощенко, М.В. Чубик
Опубликовал Константин Моканов
Источник
До применения инсулина продолжительность жизни больного сахарным диабетом составляла не более 10 лет. Изобретение этого препарата спасло миллионы пациентов. Человеческий генно-инженерный инсулин – последнее достижение науки.
Результат многолетней напряженной работы
История
До изобретения генно-инженерного (рекомбинантного) препарата инсулин выделяли из поджелудочной железы крупного рогатого скота и свиней.
Отличие свиного инсулина от человеческого – только одна аминокислота
Недостатки этого способа получения препарата:
- сложность хранения и транспортировки биологического сырья;
- недостаток поголовья скота;
- трудности, связанные с выделением и очисткой гормона поджелудочной железы;
- высокий риск развития аллергических реакций.
С синтезирования в биореакторе натурального человеческого инсулина в 1982 году началась новая биотехнологическая эпоха. Если на заре инсулинотерапии целью ученых было только выживание пациента, в наше время разработка новых препаратов направлена на достижение стойкой компенсации заболевания. Основная цель научных разработок – улучшить качество жизни больного сахарным диабетом.
Современные технологии
Рекомбинантный инсулин
Виды препарата в зависимости от способа получения:
Генно-инженерный рекомбинантный
Для производства используется генетически измененная кишечная палочка.
Преимущества:
- отсутствие аллергических реакций;
- экономичность производства;
- высокая степень очистки.
Любимица генетиков – кишечная палочка
Генно-инженерный модифицированныйИсходный материал – инсулин свиньи. Производится его модификация генно-инженерным способом.
Структура гормона
СинтетическийИскусственно синтезированный препарат, по своему составу полностью идентичен человеческому инсулину.
Производство лекарства
Что происходит в организме после введения препарата?
Подкожная инъекция
Соединяясь с рецептором клеточной мембраны, инсулин образует комплекс, который осуществляет следующие процессы:
- Улучшает внутриклеточную транспортировку глюкозы и облегчает ее усваивание.
- Способствует выделению ферментов, которые участвуют в переработке глюкозы.
- Снижает скорость образования в печени гликогена.
- Стимулирует жировой и белковый обмен.
В случае подкожного введения инсулин начинает действовать через 20-25 минут. Время действия препарата от 5 до 8 часов. В дальнейшем расщепляется ферментом инсулиназой и выводится с мочой. Препарат не проникает через плаценту и не попадает в грудное молоко.
Когда назначают генно-инженерный инсулин?
Если необходима срочная помощь
Генно-инженерный человеческий инсулин применяется в следующих случаях:
- Сахарный диабет 1 или 2 типа. Используется в качестве самостоятельного лечения или в комплексе с другими препаратами.
- При резистентности к пероральным сахароснижающим средствам.
- При диабете у беременных женщин.
- В случае осложнений со стороны почек и печени.
- При переходе на инсулин пролонгированного действия.
- В предоперационном периоде.
- В случае развития угрожающих жизни состояний (гиперосмолярной или кетоацидотической комы).
- В экстренных ситуациях (перед родами, при травмах).
- Если имеются дистрофические поражения кожи (язвы, фурункулез).
- Лечение сахарного диабета на фоне инфекции.
Человеческий генно-инженерный инсулин хорошо переносится и не вызывает аллергических реакций, так как полностью идентичен природному гормону.
Важен постоянный контроль!
Запрещено назначение лекарства в случае:
- снижения уровня сахара в крови;
- повышенной чувствительности на препарат.
В первые дни после назначения препарата необходимо внимательное наблюдение за пациентом.
Побочные эффекты
Крапивница
Опасность! Отек Квинке!
В редких случаях при применении инсулина возможны следующие осложнения:
- аллергические реакции (крапивница, отек Квинке, зуд кожи);
- резкое снижение уровня сахара в крови (развивается из-за отторжения препарата организмом или в случае иммунологического конфликта);
- нарушения сознания;
- в тяжелых случаях возможно развитие гипогликемической комы;
- жажда, сухость во рту, вялость, снижение аппетита;
- гипергликемия (при применении препарата на фоне инфекции или лихорадки);
- покраснение лица;
- местные реакции в области введения (жжение, зуд, атрофия или разрастание подкожной жировой клетчатки).
Иногда адаптацию к препарату сопровождают такие нарушения, как отеки и нарушения зрения. Эти проявления, как правило, исчезают через несколько недель.
Как найти в аптеке генно-инженерный инсулин?
Лекарство выпускается в виде раствора для парентерального введения:
«Биосулин»
Средняя продолжительность действия
«Актрапид»
Инсулин короткого действия
«Генсулин»
Двухфазный препарат (комбинация инсулинов короткой и средней продолжительности действия)
«Ринсулин»
Быстрый эффект
«Хумалог»
Для введения лекарства используется шприц-ручка
Подобрать препарат инсулина с учетом индивидуальных особенностей пациента не составит труда.
Важно! Назначать инсулин может только врач! Он же рассчитывает дозу и контролирует состояние пациента во время курса лечения. Самолечение может привести к трагическим последствиям.
Правила использования
Чаще всего применяется подкожное введение инсулина.
Формирование складки
В неотложных случаях лекарство вводится внутривенно.
При тяжелом состоянии пациента
Даже диабетик со стажем может допустить ошибку при применении препарата.
Для того, чтобы избежать осложнений, необходимо:
- Перед использованием проверить срок годности лекарства.
- Соблюдать рекомендации по хранению: запасные флаконы должны храниться в холодильнике. Начатый флакон можно хранить при комнатной температуре в темном месте.
- Убедитесь, что хорошо запомнили нужную дозировку: еще раз прочитайте рецепт врача.
- Перед инъекцией обязательно выпустить воздух из шприца.
- Кожа должна быть чистой, но использовать спирт для обработки нежелательно, так как он снижает эффективность препарата.
- Выбрать оптимальное место для инъекции. При введении под кожу живота препарат подействует быстрее. Медленнее всасывается инсулин при введении в ягодичную складку или плечо.
- Использовать всю площадь поверхности (профилактика развития местных осложнений). Расстояние между инъекциями должно быть не меньше 2 см.
- Захватить кожу в складку, чтобы снизить риск попадания в мышцу.
- Шприц вводить под кожу под углом, чтобы лекарство не вытекло.
- При инъекциях в живот инсулин короткого действия вводить за 20 минут до приема пищи. В случае выбора плеча или ягодицы – за тридцать минут до еды.
Сочетание с другими лекарственными средствами
Зачастую при сахарном диабете больной принимает несколько медицинских препаратов. Сочетание с другими лекарственными средствами может оказать влияние на лечебное действие генно-инженерного инсулина.
Для профилактики осложнений необходимо знать:
Увеличивают эффект генно-инженерного инсулина, понижая сахар в крови
- Сульфаниламиды.
- Ингибиторы МАО (фуразолидон).
- Ингибиторы АТФ (каптоприл).
- Нестероидные противовоспалительные (диклофенак, аспирин).
- Андрогены.
- Противомалярийные препараты (хинидин).
- Анаболические стероиды.
- Антибиотики тетрациклинового ряда (доксициклин).
- Теофиллин.
- Морфин.
Уменьшают действие инсулина
- Глюкокортикоиды (преднизолон, гидрокортизон).
- Эстрогенсодержащие пероральные контрацептивы.
- Мочегонные.
- Амфетамины.
- Гормоны щитовидной железы.
- Симпатомиметики (адреналин, мезатон, дофамин).
- Глюкагон.
Обратите внимание!
Мочегонное
Передозировка
В некоторых случаях введение инсулина приводит к внезапному снижению уровня сахара в крови. Проблема часто возникает из-за неправильного подбора дозы препарата.
Критический уровень
Начальные симптомы гипогликемии:
- слабость;
- бледность кожи;
- состояние тревоги;
- головокружение;
- дезориентация;
- онемение рук, ног, языка и губ;
- дрожь конечностей;
- холодный пот;
- сильное чувство голода;
- головные боли.
Тремор
Внезапное ухудшение самочувствия
Если вы заметили у себя подобные симптомы, нужно быстро съесть что-нибудь, содержащее легкоусвояемые углеводы. Это может быть печенье, конфета, кусочек сахару или белого хлеба. Хорошо помогает в таких ситуациях сладкий чай.
При ухудшении состояния необходимо вызвать скорую помощь. Гипогликемия может закончиться комой или смертью пациента.
Врачебная помощь: струйное вливание в вену 40% раствора глюкозы, введение глюкагона.
Частые вопросы врачу
Применение генно-инженерного инсулина при беременности
Добрый день! Меня зовут Снежана. С детства страдаю сахарным диабетом. В последнее время использую «Актрапид». Несколько дней назад узнала о своей беременности. Я боюсь, что генно-инженерный препарат может повлиять на развитие ребенка, вызвать какие-нибудь мутации. Скажите пожалуйста, может мне заменить лекарство?
Здравствуйте, Снежана. Человеческий генно-инженерный инсулин не проникает через плаценту и совершенно безопасен при беременности. Вам нужно обратиться к эндокринологу для того, чтобы скорректировать дозу.
Опасен ли рекомбинантный инсулин?
Добрый день! Врач назначил колоть «Хумалог Микс 25». Но на упаковке написано, что он рекомбинантный! Это что же, я буду вводить себе ГМО? Прочитал в интернете, что эти продукты вызывают рак.
Здравствуйте! Рекомбинантный инсулин ничем не отличается от природного. Для получения его используются генно-модифицированные бактерии.
С помощью технологий генной инженерии производится вживление рекомбинантной ДНК, содержащей ген инсулина, в клетку кишечной палочки. Генно-модифицированные организмы размножаются и вырабатывают гормон. Препарат очень эффективен и отличается высокой степенью очистки.
Читать далее…
Источник
Кишечная палочка Esherichia coli, бактерия, известная
человечеству уже полтора века,
– обычнейший обитатель нашего кишечника. Она – излюбленный объект
исследований микробиологов, биохимиков и генетиков всего мира, и
не случайно именно Esherichia coli стала первым живым
генно-модифицированным организмом, появившимся на свет в 1973
году. В ее геном был встроен ген человека, кодирующий
синтез инсулина.
В настоящее время генетически модифицированные микроорганизмы
используются для производства фармацевтических препаратов,
вакцин, продуктов тонкого органического синтеза, пищевых добавок
и многого другого. Новые штаммы кишечной палочки уже не просто
производят инсулин: они стимулируют восстановление собственных
способностей организма пациента вырабатывать этот гормон. При
диабете первого типа бета-клетки поджелудочной железы утрачивают
способность синтезировать инсулин. Ученые Корнельского
университета (Итака, штат Нью-Йорк), работающие под руководством
Джона Марча (John March), решили попытаться восстановить
этот механизм с помощью сигнальной системы, используемой
выстилающими кишечник эпителиальными клетками и населяющими его
полезными бактериями. Созданный в лаборатории Марча штамм
непатогенной кишечной палочки синтезирует белок GLP-1 –
глюкагоноподобный пептид. В организме здорового человека этот
белок синтезируется клетками кишечника и, среди прочих эффектов,
запускает продукцию инсулина в поджелудочной железе. Авторы
продемонстрировали, что в лабораторных условиях в присутствии
глюкозы секретирующие GLP-1 бактерии запускают синтез инсулина в
культуре клеток кишечника человека. Механизмы, лежащие в основе
этого феномена, пока не ясны. Спектр применения – колоссальный, к
примеру, обычный йогурт, обогащенный такими бактериями, сможет
заменить больным диабетом инъекции инсулина! Кроме бактерий для
лечения диабета, группа Марча работает над созданием целого ряда
целебных штаммов микроорганизмов, в том числе предназначенных для
борьбы с кариесом, синтеза витаминов, лечения непереносимости
лактозы и профилактики холеры.
Стало известно о результатах исследования группы генетиков из
Массачусетского технологического института под руководством
профессора Рона Вайса (Ron Weiss), специалиста в области
синтетической биологии. В этом исследовании ученые пытаются
сделать кишечную палочку бактерией-охотником за одной из самых
опасных внутрибольничных инфекций – синегнойной палочкой
(Pseudomonas aeruginosa), олицетворяющей одну из главных проблем
современной медицины — резистентности патогенных микробов к
антибиотикам. Если пациенту в больнице внезапно становится плохо,
и антибиотики не помогают, то обычно главной причиной этого
оказывается именно “синегнойка” — агрессивный обитатель
хирургических отделений, виновник тысяч жертв. Ученые в
буквальном смысле «натравили» кишечную палочку на «синегнойку» –
модифицировали бактерию так, что она научилась «выслеживать» и
убивать клетки Pseudomonas, обитающие в ранах и абсцессах.
Esherichia coli находит клетки синегнойной палочки, что
называется, «по запаху». Дело в том, что клетки опасного патогена
общаются друг с другом внутри своей колонии с помощью различных
сигнальных веществ. Модифицированная E.Coli реагирует на это
вещество, связываясь с ним особым протеином, и, обнаружив
псевдомонаду, убивает ее с помощью яда, получившего название
бактериоцин. Попадая внутрь клетки синегнойной палочки, подвижной
и устойчивой к большинству антибиотиков, бактериоцин разрушает ее
ДНК. Рон Вайс и его коллеги показали, что генетически
модифицированная кишечная палочка в лабораторной жидкой культуре
убивает “синегнойку”, не причиняя вреда себе, а также другим
неопасным бактериям. Этот метод испытан пока лишь в лаборатории,
но ученые считают, что возможно сделать лечебный штамм кишечной
палочки в 20 раз сильнее опытного экземпляра. И тогда испытать на
млекопитающих, а также подумать о возможных лекарственных формах
пробиотиков.
Генно-модифицированные штаммы кишечной палочки ученые намерены
использовать и для решения одной из проблем века – ожирения. Как
показывают исследования, добавление в еду подопытным мышам
особого штамма E.Coli , в геном которой введен ген растения
резуховидки, помогает избавить от лишнего веса подопытных мышей.
Бактерии ориентированы на синтез особого вещества под названием
NAPE, которое организм млекопитающих превращает в гормон,
вырабатываемый в процессе переваривания пищи. Этот гормон
поступает через кровь в мозг и, сигнализируя о насыщении,
уменьшает аппетит. Получается, что бактерия заставляет мышей
думать, что они едят больше, чем на самом деле. В исследовании,
опубликованном в журнале The Journal of Clinical Investigation,
грызунов, которым добавляли бактерии в питьевую воду, и грызунов
из контрольной группы кормили высококалорийной пищей. У мышей,
которые употребляли бактерии, снизился аппетит, они перестали
набирать вес и начали показывать меньшую инсулиновую
устойчивость. Эффект сохранялся около четырех недель. Ученые
считают, что эти бактерии можно использовать в пробиотиках для
употребления людьми. Если препарат окажется действенным и
безопасным, то он даст большую фору существующим лекарствам
против ожирения.
Пробиотики, изготовленные с добавлением модифицированной кишечной
палочки, как считают ученые – это одно из лекарств будущего, ведь
для этой бактерии кишечник человека – естественное местом ее
обитания. Однако, несмотря на первые успехи, авторы отмечают, что
им еще предстоит ответить на несколько непростых вопросов.
Например, необходимо выяснить, насколько опасны подобные
вмешательства в естественную микрофлору кишечника, индивидуальную
для каждого человека.
Источник